利用脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)構(gòu)建組織工程化兔板層角膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜是位于眼表的透明組織，具有屏障外界刺激和屈光等重要功能，包括5層結(jié)構(gòu)：復(fù)層角膜上皮，前彈力層，角膜基質(zhì)層，后彈力層，單層內(nèi)皮細(xì)胞。嚴(yán)重、持續(xù)的角膜損傷會(huì)造成角膜潰瘍，穿孔，瘢痕形成，最終影響視功能。目前角膜病已成為全球第二大致盲眼病。作為可逆性盲，角膜移植是治療角膜盲的主要手段。在我國(guó)，由于移植材料的來(lái)源匱乏，每年能夠進(jìn)行的角膜移植手術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足臨床幾百萬(wàn)例的等待需求，組織工程化角膜是解決這一問(wèn)題的有效途徑。
　　 目前組

2、織工程角膜的研究因所選用支架材料的不同，構(gòu)建的角膜替代物有著不同的表現(xiàn)。以合成材料作為支架材料所構(gòu)建的組織工程角膜，由于材料本身不能完全模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分，往往在生物力學(xué)、光學(xué)性能以及生物學(xué)特性等方面存在不同程度的不足。而異種角膜是一種良好的角膜支架材料來(lái)源，本實(shí)驗(yàn)室所開(kāi)發(fā)的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Acellular porcine cornea stroma,APCS)在前期研究證實(shí)其具有足夠的生物力學(xué)強(qiáng)度，高度的透明性；角膜基

3、質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)成分的保留使其具有良好的生物學(xué)特性，能夠滿(mǎn)足組織工程角膜構(gòu)建的要求。因此本課題：
　　 目的：
　　 利用自行研制的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)作為支架材料，體外構(gòu)建組織工程化的兔板層角膜。
　　 方法：
　　 1.制備角膜構(gòu)建需要的支架材料，并對(duì)其進(jìn)行HE染色以檢測(cè)脫細(xì)胞情況，利用蛋白多糖檢測(cè)試劑盒鑒定脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)中氨基葡聚糖的含量；并檢測(cè)脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)在2小時(shí)內(nèi)的吸水率。
　　

4、 2.取新西蘭大白兔顳上象限角膜緣小組織塊，種植在經(jīng)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)復(fù)水的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)片上，使用自行研制的干燥裝置進(jìn)行體外培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1、2、3周取材時(shí)對(duì)構(gòu)建的板層角膜表層細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行倒置相差顯微鏡的觀(guān)察，取到的板層角膜進(jìn)行石蠟包埋后HE染色觀(guān)察板層角膜的組織結(jié)構(gòu);通過(guò)透射電鏡對(duì)板層角膜的復(fù)層上皮細(xì)胞間以及細(xì)胞與基質(zhì)問(wèn)的連接情況進(jìn)行檢查，免疫熒光染色檢測(cè)板層角膜基底膜組分纖維

5、連接蛋白和層粘連蛋白的形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)進(jìn)行HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理的豬角膜墓質(zhì)中未見(jiàn)到任何完整細(xì)胞或細(xì)胞碎片，膠原板層結(jié)構(gòu)未破壞。蛋白多糖定量分析，脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)較正常角膜在脫細(xì)胞過(guò)程中丟失了20％左右的氨基葡聚糖，但是在吸水率檢測(cè)中，2小時(shí)內(nèi)脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)仍可恢復(fù)至正常含水量。
　　 2.使用角膜緣小組織塊構(gòu)建正常含水量板層角膜。倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)到其表層上皮

6、細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中呈典型的“鋪路石”樣外觀(guān)。組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)均顯示角膜上皮細(xì)胞在支架材料上能夠良好黏附，生長(zhǎng)，增殖，遷移并分化，所形成的復(fù)層結(jié)構(gòu)類(lèi)似于天然角膜上皮細(xì)胞的極性分布；同時(shí)，透射電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞——細(xì)胞問(wèn)和細(xì)胞——細(xì)胞外基質(zhì)間連接形成，可見(jiàn)到成熟的緊密連接，半橋粒等結(jié)構(gòu)。免疫熒光顯示構(gòu)建的板層角膜，基底膜組分纖維連接蛋白和層粘連蛋白的表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：
　　 以脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)為支架材料所構(gòu)建的兔板層角膜，