捕食線蟲性真菌的分離鑒定及少孢節(jié)叢孢菌黏附分子與線蟲相互作用初步研究.pdf

1、動物消化道線蟲病是嚴重危害畜牧業(yè)發(fā)展的寄生蟲病,每年給畜牧業(yè)造成巨大的損失。目前,該病的防治主要依賴于化學藥物。然而,隨著化學藥物對線蟲防控弊端的日益凸現(xiàn),目前需尋求一種動物--環(huán)境友好型線蟲病防控方法。近年來,利用線蟲的天敵--食線蟲性真菌對線蟲進行生物防控備受關注。少孢節(jié)叢孢菌作為捕食線蟲性真菌代表種之一,隨著對其全基因組的測序成功和部分基因功能的研究,為闡明真菌作用線蟲的分子機制奠定了前期基礎。少孢節(jié)叢孢菌對線蟲的作用包括吸引、識

2、別和黏附、侵染、消解等過程,其中黏附是最關鍵的一步,是捕食線蟲性真菌捕食線蟲的基礎。因此,對少孢節(jié)叢孢菌黏附線蟲的研究不但可以揭示真菌與線蟲相互作用的分子機制,而且對新型線蟲生物防控制劑的研發(fā)具有重要的意義。
　　本研究對新疆阿勒泰地區(qū)的食線蟲性真菌進行了分離與鑒定,并選取其中少孢節(jié)叢孢菌A1株作為研究對象,克隆了該菌的一種黏附蛋白(命名為ADP1)基因,并將其與綠色熒光蛋白(GFP)基因融合后在大腸桿菌中進行了表達。表達的融合蛋

3、白純化后,通過與線蟲的相互作用驗證了其黏附功能,為進一步揭示真菌黏附線蟲的分子機制及高捕食活性真菌的選育奠定了良好的前期基礎。主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1.捕食線蟲性真菌的分離鑒定及氨基酸對其捕食器誘導效應研究
　　為了解新疆阿勒泰地區(qū)的捕食線蟲性真菌分布情況,采用玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)分離培養(yǎng)阿勒泰地區(qū)土壤中的捕食線蟲性真菌,通過對純化后菌株的形態(tài)學觀察和分子生物學分析,鑒定出5株少孢節(jié)叢孢菌和1株圓錐節(jié)叢孢菌。采

4、用濃度分別為0.5、0.05、0.005g/L的L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸和L-纈氨酸對已分離的圓錐節(jié)叢孢菌AS3株進行捕食器的誘導,發(fā)現(xiàn)各組氨基酸對捕食器的產(chǎn)生均有誘導效應,且以0.05g/L的L-苯丙氨酸誘導產(chǎn)生的捕食器總數(shù)最多。
　　2.少孢節(jié)叢孢菌黏附分子ADP1基因的克隆、序列分析及其表達研究
　　通過PCR方法擴增了少孢節(jié)叢孢菌(新疆分離株A1)黏附蛋白ADP1基因,經(jīng)測序后對其基本理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進行了

5、預測。通過酶切的方法將其與GFP基因進行融合,構(gòu)建融合蛋白表達載體pET28a-GFP-ADP1和pET28a-GFP蛋白,分別在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)目的融合蛋白和對照GFP蛋白分子量大小分別約50 KDa和35 KDa,與預期大小相符。紫外分光光度法測定GFP蛋白和GFP-ADP1蛋白的表達量分別為15.3 mg/mL和12.6mg/mL。
　　3.重組融合蛋白GFP-ADP1的純化及其

6、與線蟲作用初步研究
　　將表達了的融合蛋白GFP-ADP1和對照蛋白GFP進行純化,配成相同的物質(zhì)量濃度于25℃條件下分別與活的的秀麗隱桿線蟲J3期幼蟲作用1h,用PBS溶液漂洗蟲體,分別置于熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn) GFP-ADP1蛋白組的線蟲表面仍能觀測到綠色熒光,而GFP組在漂洗后檢測不到綠色熒光,提示GFP-ADP1蛋白對線蟲具有黏附作用。在4、16、25和37℃的溫度下,GFP-ADP1對線蟲發(fā)生作用1h后,經(jīng)漂洗在熒