腸道病毒71型不同毒力表型分離株感染ICR鼠的研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科（Picornavirdae），腸道病毒屬（Enterovirus，EV）。EV71是導(dǎo)致手足口病(HFMD)最為常見的病原體之一，通常引起患者手、足、口腔等部位皮膚粘膜的皮疹、皰疹，可自愈。個(gè)別可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等，以嬰幼兒和5歲以下兒童感染為主，致殘及病死率較高[1]。
　　 近年來(lái)EV71病毒感染在亞太國(guó)家和地區(qū)的流行呈上升趨勢(shì)

2、。然而，目前仍沒有特效的藥物或疫苗用于EV71感染的防治，EV71的致病機(jī)制也不明了。動(dòng)物模型是進(jìn)行病毒致病機(jī)制、感染特點(diǎn)的研究和病毒疫苗及藥物療效評(píng)價(jià)的重要手段，但目前尚未找到可用于EV71研究的動(dòng)物模型。本研究針對(duì)目前我國(guó)EV71動(dòng)物模型方面研究的匱乏與病毒分子機(jī)制研究的需要，運(yùn)用分離自山東臨沂手足口病患兒的EV71分離株SDLY107與SDLY11株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期建立一個(gè)不同毒力表型分離株的EV71動(dòng)物感染模型，旨在探討EV71不

3、同毒力表型分離株引起不同臨床表現(xiàn)的原因。
　　 本次研究采用EV71山東分離株SDLY107(死亡患兒分離株)、SDLY11（儀表現(xiàn)皮疹和發(fā)熱的輕癥患兒分離株）分別對(duì)1日齡，2周齡ICR乳鼠經(jīng)腹腔注射感染，同時(shí)對(duì)感染小鼠進(jìn)行了臨床表現(xiàn)、病原學(xué)、病毒分子生物學(xué)和病理學(xué)等方面的研究，從而建立起EV71不同毒力表型分離株小鼠感染模型，對(duì)今后開展EV71毒力相關(guān)致病機(jī)制的研究具有重要意義。
　　 目的:
　　 1.比較E

4、V71輕重癥分離株感染不同日齡ICR小鼠后的感染特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究EV71感染后引起不同癥狀的原因提供依據(jù)。
　　 2.用本實(shí)驗(yàn)室建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR測(cè)定EV71 RNA病毒拷貝數(shù)的方法，檢測(cè)EV71輕、重癥分離株分別感染1日齡和2周齡小鼠后肌肉組織EV71 RNA拷貝數(shù)，評(píng)價(jià)輕、重癥分離株在小鼠體內(nèi)復(fù)制情況的差異。
　　 3.ELISA試驗(yàn)法逐日測(cè)定1日齡和2周齡小鼠血清中EV71抗體滴

5、度，評(píng)價(jià)輕、重癥分離株病毒分別感染后宿主的抗體生成情況，從而判斷病毒在宿主體內(nèi)的中和情況，為進(jìn)一步研究SDLY107與SDLY11感染小鼠后產(chǎn)生不同毒力的原因提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.采用EV71山東分離株SDLY107(死亡患兒分離株)、SDLY11（僅表現(xiàn)皮疹和發(fā)熱的輕癥患兒分離株）分別對(duì)1日齡，2周齡ICR乳鼠經(jīng)腹腔注射感染（CCID50均為10-4）。
　　 2.將動(dòng)物按日齡及處理方式分組，分別

6、為1日齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)A組、1日齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)B組、1日齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)C組、1日齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)D組、1日齡對(duì)照組E組、2周齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)F組、2周齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)G組、2周齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)H組、2周齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)Ⅰ組2周齡對(duì)照組J組，每組5～10只，通過腹腔注射途徑感染，其中對(duì)照組用生理鹽水感染。
　　 3.病毒接種后觀察小鼠臨床表現(xiàn)并于3d、4d、5d、6d、7d采集1日齡SD

7、LY107株實(shí)驗(yàn)A組、1日齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)C組、2周齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)F組、2周齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)H組肺、腦、腸、肌肉組織。
　　 4.將1日齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)B組、1日齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)D組、2周齡SDLY107株實(shí)驗(yàn)G組、2周齡SDLY11株實(shí)驗(yàn)Ⅰ組、1日齡對(duì)照組E組及2周齡對(duì)照組F組小鼠連續(xù)兩周每天取一只摘眼球取血，用間接ELISA試驗(yàn)法檢測(cè)小鼠血清抗體滴度，并取其肌肉組織進(jìn)行病毒拷貝數(shù)的測(cè)定。
　　

8、 5.建立SYBR GreenⅠ熒光染料實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定EV71病毒載量的方法。使用含有目的序列RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)對(duì)該方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)小鼠體內(nèi)各組織中的病毒拷貝數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
　　 結(jié)果:
　　 1.ICR1日齡乳鼠和2周齡乳鼠分別經(jīng)腹腔注射感染SDLY107、SDLY11分離株后，SDLY107分離株感染的乳鼠表現(xiàn)出明顯的癥狀，包括豎毛、弓背、消瘦、肢體麻痹，SDLY1

9、1分離株感染的乳鼠癥狀明顯較輕，對(duì)照組（生理鹽水）乳鼠無(wú)明顯變化。各組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，SDLY107與SDLY11感染的乳鼠各臟器均表現(xiàn)出病理變化，SDLY107病理變化更明顯，對(duì)照組未觀察到病理變化。
　　 2.建立了SYBR GreenⅠ熒光染料實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定EV71病毒RNA拷貝數(shù)的方法。該方法敏感性高、穩(wěn)定性好，可用于EV71病毒RNA的定量測(cè)定。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，SDLY107在各組織中

10、的病毒載量均高于SDLY11，肌肉組織中病毒載量最高。感染SDLY107的1日齡乳鼠肌肉組織病毒拷貝數(shù)于5d達(dá)到最高值，為6.02×104 copies/μl。感染SDLY11的1日齡乳鼠肌肉組織病毒拷貝數(shù)于7d達(dá)到最高值，為3.27×104 copies/μl。
　　 3.ELISA結(jié)果顯示，隨著感染天數(shù)的增加，小鼠血清抗體的A值檢出增加，其中1日齡小鼠的血清抗體A值最高出現(xiàn)在7d，2周齡小鼠的血清抗體A值最高出現(xiàn)在8d。2周

11、齡小鼠的血清產(chǎn)生抗體水平明顯高于1日齡小鼠。相同日齡小鼠感染SDLY107和SDLY11，血清抗體A值具有相同的趨勢(shì)。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同毒力表型的分離株在ICR乳鼠感染中表現(xiàn)出不同致病能力。
　　 2.不同毒力表型的分離株在ICR乳鼠體內(nèi)表現(xiàn)出不同的復(fù)制能力。這種復(fù)制能力的不同可能與感染后引起不同臨床表型有關(guān)，而復(fù)制能力的改變可能取決于病毒自身與復(fù)制有關(guān)的區(qū)域關(guān)鍵氨基酸突變，也與宿主自身產(chǎn)生抗體對(duì)病毒