PSGL-1 參與腸道病毒 71 型感染誘導的細胞自噬.pdf

1、目的：
　　小兒手足口病（Hand-foot-mouth Disease，HFMD）是一種死亡率高、伴有兒童相關的無菌性腦膜炎和嚴重的神經系統并發(fā)癥的季節(jié)性流行性感染性疾病，主要是腸道病毒71型（human enterovirus71，EV71）感染。因此，本實驗從病毒受體與細胞自噬角度，利用細胞形態(tài)學、蛋白相互作用等研究方法，探究了P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSG

2、L-1）在腸道病毒71型感染正常胃上皮細胞（normal gastric epithelial cell line-1，GES-1）誘導自噬調變中的作用，旨在為明確EV71致病機制提供重要的理論基礎和實驗依據，為手足口病的早期預防和臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1．細胞培養(yǎng)與病毒感染
　　分別培養(yǎng)人胃上皮細胞和橫紋肌肉瘤細胞（rhabdomyosarcoma，RD-A），將細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清（feta

3、l bovine serum，FBS）和1%青霉素/鏈霉素(200 U/ml)的L-谷氨酰胺DMEM培養(yǎng)基內，并置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱。待細胞增長至90%，經不含EDTA的胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。EV71（fuyang-0805）以一定的感染復數（indicated multiplicity of infection，MOI）感染GES-1。病毒感染3 h后清洗細胞，然后用含2%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)，到感染的時

4、間點后收取培養(yǎng)細胞和上清液。收集感染細胞內的病毒顆粒前，要3次反復凍融細胞。病毒原液存放在-80℃冰箱，感染之前4℃復蘇，病毒滴度可通過50%組織培養(yǎng)感染劑量（50%tissue culture infectious doses，TCID50）表示，根據Reed–Muench法使用96孔板接種RD-A細胞進行不同病毒濃度梯度的感染來測定TCID50。
　　2．細胞處理
　　GES-1細胞以EV71滴度為MOI=10分別感染6

5、、12、24小時。封閉時，在感染前用含PSGL-1抗體(2 mg/ml)培養(yǎng)基培養(yǎng)GES-1，阻止EV71與細胞受體PSGL-1的結合。通過熒光顯微鏡檢測自噬標記蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)時，將培養(yǎng)的GES-1轉染RFP-LC3/GFP-LC3質粒24小時后進行病毒感染，最后觀察并在同一倍鏡計數5個不同視野下細胞中熒光聚集點的數目和DAPI

6、染色的細胞核數，并計算LC3熒光斑點數/細胞數的百分率。
　　3．實時熒光定量PCR
　　用TRIzol Reagent分別從不同GES-1細胞處理組提取細胞的總RNA，并通過快速cDNA第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA(2μg)轉換為cDNA。采用the Bestar? SybrGreen qPCR Mastermix通過實時熒光定量PCR技術檢測PSGL-1的RNA水平變化，設置熱循環(huán)條件：95℃初始變性2分鐘；95℃變

7、性10秒，退火溫度63℃30秒，最后延伸72℃30秒，共40次循環(huán)。
　　4．免疫熒光顯微鏡
　　在4℃用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（PBS）固定細胞20分鐘后清洗；用含1%Triton X-100的PBS在室溫細胞穿孔15分鐘；用含5%牛血清白蛋白PBS液在室溫封閉60分鐘；用LC3與PSGL-1單克隆抗體在4℃孵育，過夜。次日，清洗后加入熒光標記的二抗，并加入DAPI核染色；然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。
　

8、　5．免疫印跡和免疫共沉淀
　　收集細胞并裂解；測定蛋白質濃度；樣品通過SDS-PAGE電泳分離，并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；膜用5%脫脂奶粉常溫封閉2小時，然后分別孵育P62抗體， LC3抗體，VP1抗體，PSGL-1和β-actin抗體4℃過夜；清洗后，用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗在室溫下孵育1小時。最后使用化學發(fā)光顯影劑顯影。免疫共沉淀：在4℃過夜孵育細胞裂解液與單克隆抗體(1 mg)后加入Protein G

9、 Agarose珠子，進行2小時的搖動孵育；洗滌珠子后溶解，取免疫共沉淀緩沖液通過12%的SDS-PAGE進行電泳分離（方法同免疫印跡）。
　　6．統計分析
　　采用t檢驗進行統計學比較，P<0.05判斷有統計學意義。
　　結果：
　　1. EV71感染誘導GES-1細胞發(fā)生自噬：免疫印跡結果顯示隨著病毒感染時間的增加，LC3II逐漸增加，LC3-I向LC3II轉換明顯；且在12 h后呈明顯增加(P<0.05)，

10、同時免疫熒光結果顯示病毒感染12 h后LC3點狀聚集明顯增加(P<0.01)。
　　2. PSGL-1抗體封閉受體可阻止EV71感染GES-1：GES-1細胞在PSGL-1抗體預先封閉后再染毒，與未封閉組相比胞內病毒蛋白結構蛋白VP-1明顯減少(P<0.001)，同時檢測胞內病毒滴度也顯著降低(P<0.01)。
　　3. EV71感染GES-1促進PSGL-1高表達和點狀聚集：通過免疫印跡檢測顯示感染組PSGL-1明顯增多(

11、P<0.05)，同時實時熒光定量PCR測得感染組PSGL-1的mRNA水平明顯升高(P<0.05)；免疫熒光結果顯示感染組PSGL-1出現明顯點狀聚集(P<0.01)。
　　4. PSGL-1參與EV71感染GES-1誘導的細胞自噬：采用免疫熒光技術觀察發(fā)現PSGL-1可與LC3在細胞內發(fā)生共定位，通過免疫共沉淀技術檢測PSGL-1和P62有蛋白相互作用。
　　結論：
　　EV71感染GES-1誘導細胞自噬，而這一現象