腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是手足口病（hand，foot and mouthdisease，HFMD）的主要病原體之一，屬于小RNA病毒（Picornaviridae）科，腸道病毒（Enterovirus）A屬（speciesA），具有嗜神經(jīng)性，主要感染嬰幼兒和五歲以下兒童。EV71感染造成的HFMD臨床癥狀呈現(xiàn)多樣化，一般僅表現(xiàn)為患者手、足、口部位的皮疹和皰疹等，為自限性疾病，但嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)（c

2、entral nervous system，CNS）并發(fā)癥，包括脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎等，甚至造成死亡。EV71全長(zhǎng)基因組約為7.4kb，僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架（open reading fragment，ORF），兩端分別為3'UTR和5'UTR區(qū)。目前，EV71的致病機(jī)制仍不明確，我們之前的研究表明EV71的復(fù)制能力與病毒毒力相關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù)，將EV71山東分離株SDLY107株（分離自死亡患兒）與SDL

3、Y1株（分離自輕癥HFMD患兒）的2A蛋白進(jìn)行置換后，構(gòu)建了具有感染性的嵌合病毒，研究2A蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中發(fā)揮的作用。
　　目的:
　　1.對(duì)EV71不同毒力表型株（SDLY107株和SDLY1株）的2A進(jìn)行置換，構(gòu)建出EV71嵌合體的感染性克隆cDNA，從而拯救出嵌合病毒株SDLY107-2A-1;
　　2.研究原毒株和嵌合毒株在體外和體內(nèi)復(fù)制能力的差異，以期得到2A對(duì)病毒復(fù)制能力的影響;
　　3.通

4、過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究原毒株和嵌合毒株對(duì)細(xì)胞和乳鼠器官損傷作用，以期得到2A對(duì)病毒毒力的影響。
　　方法:
　　1.利用重疊PCR的方法，設(shè)計(jì)合適的引物，獲得SDLY1株的2A基因片段，雙酶切后置換到含有SDLY107株全長(zhǎng)的質(zhì)粒pMD-19T中，利用體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA后，轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，觀察到明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)后，盲傳三代，拯救出嵌合病毒SDLY107-2A-1株;

5、>　　2.用EV71通用引物EV71-S和EV71-A擴(kuò)增嵌合毒株的VP1片段，凝膠電泳進(jìn)行鑒定;以SDLY107株免疫ICR小鼠獲得的抗血清作為一抗，利用間接免疫熒光和免疫印跡等方法對(duì)嵌合病毒株進(jìn)行鑒定，測(cè)序驗(yàn)證后，用50％中點(diǎn)法和空斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度;
　　3.將強(qiáng)毒株SDLY107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY107-2A-1株分別感染細(xì)胞48h后，利用LDH試驗(yàn)和CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)不同毒株感染Vero細(xì)胞和RD細(xì)

6、胞造成的細(xì)胞損傷差異;
　　4.將強(qiáng)毒株SDLY107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY107-2A-1株分別感染細(xì)胞，在不同溫度下（37℃和39℃）進(jìn)行培養(yǎng)，每12h取一次上清，連續(xù)取樣5d，樣本統(tǒng)一凍存于-80℃。取樣完成后，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR)檢測(cè)病毒

7、體外動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，比較不同毒株在體外的復(fù)制動(dòng)力學(xué)差異;
　　5.將一日齡ICR乳鼠分為8組，每組11只，實(shí)驗(yàn)組乳鼠分別用SDLY107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株感染，每株病毒接種兩組，另設(shè)兩組對(duì)照組;另將一周齡ICR乳鼠分為5組，每組11只，將SDLY107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株分別感染一組一周齡ICR乳鼠，另設(shè)一組對(duì)照組;感染途徑為腹腔注射，其中對(duì)照組用生理鹽水注射;每天觀察一日齡乳鼠感染組

8、及對(duì)照組的臨床體征并記錄乳鼠體重;
　　6.在感染后0d～11d連續(xù)采集乳鼠后肢肌肉組織，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用qRT-PCR檢測(cè)病毒在體內(nèi)復(fù)制曲線(xiàn);在感染后1d、5d和9d采集乳鼠肺組織、腦組織、后肢肌肉組織和小腸組織，HE染色觀察乳鼠器官病變情況，免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒抗原;
　　結(jié)果:
　　1.PCR、間接免疫熒光、免疫印跡及測(cè)序證明嵌合病毒拯救成功，且測(cè)出SDLY107株、SDLY1株、SDLY

9、107-2A-1株滴度分別為2.22×105PFU/ml、0.65×105PFU/ml、1.25×105PFU/ml;
　　2.LDH實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)表明嵌合毒株SDLY107-2A-1株對(duì)細(xì)胞的損傷作用弱于強(qiáng)毒株SDLY107株，強(qiáng)于弱毒株SDLY1株(P＜0.05);
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示嵌合毒株SDLY107-2A-1株在體外37℃和39.5℃條件下復(fù)制能力均弱于強(qiáng)毒株SDLY107株，強(qiáng)于弱毒株SDLY

10、1株;嵌合毒株在乳鼠體內(nèi)復(fù)制能力弱于強(qiáng)毒株，強(qiáng)于弱毒株;
　　4.HE病理染色情況和免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明嵌合毒株對(duì)一日齡乳鼠器官造成的病理?yè)p傷介于強(qiáng)毒株和弱毒株之間;在乳鼠后肢肌肉組織中可檢測(cè)出嵌合毒株、強(qiáng)毒株及弱毒株的抗原，在腦組織中僅可檢測(cè)到嵌合毒株和強(qiáng)毒株的抗原。
　　結(jié)論:
　　1.成功拯救了嵌合體病毒SDLY107-2A-1株，其產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)和親本病毒株SDLY107株相似;
　　2.EV71嵌合

11、毒株和親本毒株在體內(nèi)外復(fù)制能力均有差異，表明2A蛋白在病毒復(fù)制能力過(guò)程中發(fā)揮作用，但2A蛋白并不是溫度敏感位點(diǎn);
　　3.EV71嵌合毒株和親本毒株對(duì)細(xì)胞和乳鼠器官組織的損傷作用均有差異，表明2A蛋白在病毒毒力中為關(guān)鍵蛋白;
　　4.嵌合毒株和強(qiáng)毒株均可在腦中復(fù)制，但弱毒株在腦中沒(méi)有復(fù)制能力，這些結(jié)果說(shuō)明2A蛋白并不能影響病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)和在腦內(nèi)復(fù)制的能力，這說(shuō)明EV71是通過(guò)2A以外的機(jī)制侵入神經(jīng)系統(tǒng)，這進(jìn)一步說(shuō)明了EV7