視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜新生血管疾病的遺傳和功能研究.pdf

1、以增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(Proliferative diabetic retinopathy，PDR)為代表的視網(wǎng)膜新生血管性疾病和以年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)為代表的脈絡(luò)膜新生血管疾病是最常見的不可逆性致盲眼病。隨著人口老年化和生活習(xí)慣的改變。這類疾病的發(fā)病率越來越高，患病人數(shù)越來越多。這類疾病后期常發(fā)展致不可逆性失明而嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，給患者和其家庭，以及社

2、會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。為了最低限度減少和消除該病帶來的痛苦，我們有必要對(duì)其進(jìn)行更深入的研究，尋找更好的防治辦法。 近年來，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展為這類疾病的研究帶來新的篇章。遺傳因素是這類疾病的重要病因之一，尋找易感基因可以為進(jìn)一步的發(fā)病機(jī)制研究提供線索，并且為臨床前診斷提供依據(jù)和工具，可以鑒定出易感人群進(jìn)行更為嚴(yán)格的隨訪和早期干預(yù)，為患者提供更有效更安全的個(gè)性化治療。新的新生血管刺激因子和抑制因子的發(fā)現(xiàn)也為這類疾病的發(fā)病機(jī)制研究

3、提供線索，為治療帶來新的希望。 本研究從遺傳學(xué)和功能學(xué)兩方面探討視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管疾病的發(fā)病機(jī)制和治療，首先探討HTRA1的遺傳變異與AMD的一個(gè)表現(xiàn)型一單眼／雙眼累及狀態(tài)的相關(guān)性；在第二部分中探討促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)基因的遺傳變異與糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關(guān)性以及相應(yīng)的功能研究；在第三部分中探討Slit-Robo信號(hào)系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管小鼠模型的抑制作用。目的：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道位于HTRA1

4、基因的啟動(dòng)子的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)rs11200638的A等位基因與AMD有強(qiáng)相關(guān)性，而且A等位基因可以增加HTRA1的表達(dá)水平。本研究的目的是探討rs11200638基因型與AMD的表現(xiàn)型-單眼／雙眼累及狀態(tài)的相關(guān)性，以及HTRA1在AMD眼球中的表達(dá)。 方法：研究對(duì)象為美國(guó)猶他州的白種人，共有774例晚期AMD患者和294例年齡匹配的健康對(duì)照者納入本研究。

5、晚期AMD患者根據(jù)單眼／雙眼狀態(tài)和病理特征分為單眼地圖狀萎縮、雙眼地圖狀萎縮、單眼脈絡(luò)膜新生血管和雙眼脈絡(luò)膜新生血管四個(gè)組。將患者和對(duì)照的血液提取DNA后采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)對(duì)rs11200638進(jìn)行基因型鑒定。采用logistic回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)rs11200638與各個(gè)組的相關(guān)性。使用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)正常和AMD患者供體眼的冰凍切片中HTRA1的表達(dá)情況。

6、 結(jié)果：所有基因型鑒定結(jié)果符合Hardy-Weinberg定律。rs11200638 A等位基因和AA基因型的頻率在各個(gè)病例組均顯著高于對(duì)照組。而且A等位基因在雙眼地圖狀萎縮患者中的頻率顯著高于單眼患者，p=0.03，在雙眼脈絡(luò)膜新生血管的患者中的頻率顯著高于單眼患者，p=0.02。AA純合子發(fā)生雙眼地圖狀萎縮的比值比(Odds ratio，OR)值是單眼OR值的3倍，發(fā)生雙眼脈絡(luò)膜新生血管的OR值是單眼的2倍。HTRA1在正常人視網(wǎng)膜

7、的血管、內(nèi)界膜和Bruch’s膜上有表達(dá)，在AMD眼球的玻璃膜疣、Bruch’s膜和視網(wǎng)膜下新生血管組織上強(qiáng)表達(dá)。 結(jié)論：HTRA1基因啟動(dòng)子SNP rs11200638的A等位基因更容易發(fā)生雙眼AMD。HTRA1在AMD的病理特征中有強(qiáng)表達(dá)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持HTRA1在AMD發(fā)病中的作用，并且為臨床上AMD患者的隨訪和預(yù)后預(yù)測(cè)提供指引。 目的：促紅細(xì)胞生成素(EPO)除了有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的功能以外，還可能是一個(gè)新的視

8、網(wǎng)膜新生血管刺激因子。糖尿病視網(wǎng)膜病變是最常見的視網(wǎng)膜新生血管疾病，和糖尿病腎病同為糖尿病微血管并發(fā)癥，兩者之間有些相同的發(fā)病機(jī)制。本研究的目的是探討EPO基因的變異與糖尿病微血管并發(fā)癥的關(guān)系，以及EPO在糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：研究對(duì)象來自三個(gè)群體，猶他2型糖尿病、糖尿病腎病遺傳學(xué)研究(Genetics of Kidneys in Diabetes，GoKinD)1型糖尿病和波士頓1型糖尿病，都是美國(guó)白種人

9、。每個(gè)群體都以PDR和終末期腎病的患者作為病例，以糖尿病病程10年以上但沒有視網(wǎng)膜病變或腎病的患者作為對(duì)照。將病例和對(duì)照的血液提取DNA后采用SNAPSHOT對(duì)EPO基因區(qū)域的17個(gè)SNP進(jìn)行基因型鑒定和相關(guān)性分析，用meta分析對(duì)三個(gè)人群的相關(guān)性資料進(jìn)行匯總分析。并用Haploview對(duì)該區(qū)域的SNP進(jìn)行單倍體分析。采用ELISA法檢測(cè)非糖尿病患者玻璃體中EPO的蛋白濃度，用Luciferase報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)評(píng)價(jià)EPO基因變異對(duì)基因

10、表達(dá)的影響，采用RT-PCR對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管小鼠模型的視網(wǎng)膜和db／db小鼠的腎臟中EPO的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果：所有基因型鑒定結(jié)果符合Hardy-Weinberg定律。在三個(gè)人群中都發(fā)現(xiàn)位于EPO基因肩動(dòng)子的rs1617640的A等位基因的頻率在病例組中顯著高于對(duì)照組。Meta分析的結(jié)果顯示等位基因相關(guān)性p<0.00001，純合子TT基因型與GG基因型比較，OR為2.21(95％可信區(qū)間(confidence

11、interval，CI)1.73-2.82)，雜合子TG基因型與GG基因型比較，OR=1.32(95％C11.05-1.65)。單倍體分析顯示rs1617640，rs507392和rs551238，這三個(gè)SNP之間有高的了連鎖不平衡，并且組成幾個(gè)單倍體，這些單倍體中危險(xiǎn)和保護(hù)性單倍體的主要差異是rs1617640的T和G的差異，而rs507392的T等位基因和rs551238的A等位基因在危險(xiǎn)和保護(hù)性單倍體中都存在。在非糖尿病的患者玻璃

12、體中，TT基因型的患者玻璃體中EPO蛋白水平是GG基因型的7.5倍。Luciferase報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)中，T等位基因與G等位基因相比Luciferase的表達(dá)增加25倍。在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管小鼠模型的視網(wǎng)膜和db／db小鼠的腎臟中，EPO的mNRA水平顯著高于對(duì)照組。 結(jié)論：EPO啟動(dòng)子SNP rs1617640的T等位基因與1型和2型糖尿病微血管并發(fā)癥都有強(qiáng)相關(guān)性。而且T等位基因可以增加EPO的表達(dá)。EPO在視網(wǎng)膜新生血

13、管和糖尿病腎病動(dòng)物模型中表達(dá)增加。這提示EPO參與了糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，可能是一個(gè)新的治療靶。 目的：Slit-Robo信號(hào)系統(tǒng)在神經(jīng)元軸突的分支中起重要作用。神經(jīng)元軸突分支和新生血管形成過程中的出芽有相近的機(jī)制，本研究的目的是探討Slit-Robo系統(tǒng)在新生血管形成中的作用。 方法：采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Robo4和Slit2在血管系統(tǒng)的表達(dá)情況。在野生型小鼠和Robo4

14、AP／AP敲入小鼠上構(gòu)建VEGF誘導(dǎo)的皮膚血管通透性增加、VEGF誘導(dǎo)的血視網(wǎng)膜屏障破壞、氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管和激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管小鼠模型。采用重組Slit2蛋白進(jìn)行干預(yù)，評(píng)價(jià)Slit2對(duì)這些模型的效應(yīng)。 結(jié)果：Robo4是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的受體，他在出芽的內(nèi)皮細(xì)胞上沒有表達(dá)，而是表達(dá)在形成血管管腔的內(nèi)皮細(xì)胞上。在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管小鼠模型中ROBO4的mRNA水平顯著高于對(duì)照組。在野生型小鼠中，在全部四個(gè)動(dòng)物模型，

15、VEGF誘導(dǎo)的皮膚血管通透性增加，VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管通透性增加，氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管和激光誘導(dǎo)的脈絡(luò)膜新生血管小鼠模型中，Slit2均可以顯著的抑制病理性血管通透性增加或者新生血管形成；而在Robo4基因敲入小鼠中，Slit2對(duì)全部這四個(gè)動(dòng)物模型沒有作用。 結(jié)論：Robo4是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的受體，Slit-Robo信號(hào)在血管系統(tǒng)中起重要作用。Slit2通過Robo4可以抑制VEGF誘導(dǎo)的皮膚和視網(wǎng)膜血管通透性增加，抑制