Ranibizumab抑制BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[課題研究背景]脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是眼內(nèi)新生血管的重要表現(xiàn)形式之一，與眼部多種疾病有關(guān)，如年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)、特發(fā)性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、眼組織胞漿菌病、高度近視黃斑變性，以及眼部腫瘤和眼外傷等，其中AMD是發(fā)達(dá)國家老年人視力喪失的首要原因。CNV常累及黃斑，引起反復(fù)出血、滲出、瘢痕形成，嚴(yán)重?fù)p害中心視力

2、。迄今為止，CNV相關(guān)疾病的治療仍是眼科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。CNV的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，普遍認(rèn)為CNV的生成是一個(gè)多細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程，其中血管生成因子與抑制因子之間平衡的破壞具有關(guān)鍵作用，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的促血管生成因子之一。目前，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子治療CNV越來越受到各國學(xué)者的重視，Ranibizumalb正是眾多針對(duì)VEGF的CNV抑制

3、劑之一。Ranibizumab，又稱rhuFabV2，商品名為L(zhǎng)ucentis，是第二代人源化的抗VEGF重組鼠單克隆抗體片段(recombinanthumanized antigen-binding fragment，rhuFab)。有可能用于治療因VEGF所介導(dǎo)的眼部新生血管性疾病。本課題采用視網(wǎng)膜電生理技術(shù)、體外細(xì)胞培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、組織病理學(xué)和功能分類基因芯片研究方法，探討了Ranibizumab在激光誘導(dǎo)色素鼠脈絡(luò)膜新生血管形

4、成和發(fā)展中的抑制作用及機(jī)制。 第一部分：Ranibizumab治療氪激光誘導(dǎo)BN大鼠視網(wǎng)膜功能學(xué)變化 目的：1．研究正常BN大鼠視網(wǎng)膜電圖和視覺誘發(fā)電位的波形特征和變化范圍。2．探討玻璃體注射Ranibizumab后對(duì)氪激光誘導(dǎo)BN大鼠視網(wǎng)膜電圖的影響。 方法：1．應(yīng)用F-ERG和F-VEP技術(shù)記錄正常BN大鼠電生理波形。2．采用眼底氪激光光凝30點(diǎn)，誘導(dǎo)建立BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管動(dòng)物模型。建模后3d治療組玻璃體

5、內(nèi)注射Ranibizumab，采用ISCEV建議的視網(wǎng)膜電圖標(biāo)準(zhǔn)五項(xiàng)記錄各組不同觀察時(shí)間點(diǎn)(3d，1w、2w、4w)視網(wǎng)膜電圖波形。 結(jié)果：1．隨著刺激光強(qiáng)度的增加BN大鼠暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖的a、b波的潛伏期逐漸縮短，幅值逐漸升高；隨著刺激閃光強(qiáng)度的增加BN大鼠閃光VEP的P波的潛伏期逐漸縮短，幅值無明顯變化；2．激光誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)，暗適應(yīng)視網(wǎng)膜最大反應(yīng)視網(wǎng)膜電圖的a、b波潛伏期均無明顯變化，視網(wǎng)膜電圖的a、b波幅值逐漸降低；R

6、anibizumab治療后4w，視網(wǎng)膜電圖b波幅值完全恢復(fù)正常。 結(jié)論：記錄出正常BN大鼠視覺電生理圖形波動(dòng)和變化范圍：Ranibizumab可以改善氪激光誘導(dǎo)的BN大鼠視網(wǎng)膜功能。 第二部分：Ranibizumab抑制huvec和RPE細(xì)胞增殖和遷移的實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討Ranibizumab對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。 方法：采用MTT比色法，觀察不同濃度的Ranibizu

7、mab對(duì)huvec和RPE細(xì)胞增殖的影響，Transwell小室檢測(cè)Ranibizumab對(duì)huvec和RPE細(xì)胞遷移的影響。 結(jié)果：1．MTT比色法顯示，Ranibizumab對(duì)huvec和RPE細(xì)胞增殖具有抑制作用，隨著濃度的增加，Ranibizumab對(duì)huvec和RPE細(xì)胞增殖抑制作用也增強(qiáng)。2．Ranibizumab濃度為0.01、0.1、1mg/ml時(shí)遷移至Transwell小室膜下的huvec細(xì)胞數(shù)分別為112.6

8、8±10.03、58.17±6.52、31.67±4.84(P＜0.01 vs con)。穿膜的RPE細(xì)胞數(shù)分別為162.4±14.5、82.6±11.9、56.3±10.7，而對(duì)照組為171.2±9.2個(gè)。0.1mg/ml和1mg/ml藥物干預(yù)組遷移的RPE細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少(P＜0.01 vs con)。 結(jié)論：Ranibizumab能夠抑制huvec和RPE細(xì)胞的增殖和遷移，且具有明顯的濃度依賴性，這可能是其抑制血管生成的途

9、徑之一。 第三部分：Ranibizumab治療氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV的形態(tài)學(xué)研究 目的：在體研究Ranibizumab治療后氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV的形態(tài)學(xué)變化。 方法：氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV后2w，應(yīng)用FFA、HE染色和FITC標(biāo)記的鋪片免疫組化形態(tài)學(xué)方法觀察Ranibizumab對(duì)CNV的抑制作用。 結(jié)果：Ranibizumab治療后2w，HE染色BN大鼠CNV相對(duì)厚度變薄；FFA結(jié)果顯示激光斑滲

10、漏評(píng)分分值降低；FITC鋪片標(biāo)記CNV熒光面積減少。 結(jié)論：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ranibizumab對(duì)氪激光誘導(dǎo)的BN大鼠CNV有明顯的抑制作用。 第四部分：氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV及玻璃體內(nèi)注射Ranibizumab后 目的：1．觀察氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV后不同觀察時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體基因表達(dá)的變化。2．檢測(cè)玻璃體內(nèi)注射Ranibizumab后2wBN大鼠視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體基因表達(dá)的變化。

11、 方法：應(yīng)用大鼠血管生成功能分類基因芯片(119個(gè)基因)檢測(cè)氪激光誘導(dǎo)BN大鼠CNV及玻璃體內(nèi)注射Ranibizumab后功能分類基因芯片表達(dá)變化。 結(jié)果：1．在激光光凝后3d、1w時(shí)，上調(diào)基因大多是CCL、IL、PDGF等促炎性反應(yīng)因子。光凝后2w，上調(diào)基因以VEGF、TGF、TNF等促新生血管因子表達(dá)上調(diào)為主。2．與CNV2w組相比，玻璃體注射Ranibizumab后(CNV2w-T組)，CNV2w-T組/CNV2w組

12、上調(diào)基因14個(gè)，下調(diào)基因11個(gè)，與相應(yīng)基因位置比對(duì)后可見，Ranibizumab治療后VEGF、VEGF受體KDR、TGF等新生血管促進(jìn)基因明顯下調(diào)。 結(jié)論：1．在氪激光誘導(dǎo)CNV的早期階段(誘導(dǎo)后3d和1w)，表現(xiàn)為眼部的炎癥反應(yīng)和免疫活化在CNV的早期發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。2．在CNV的早期階段(炎性期)，單核細(xì)胞(MPC-1誘導(dǎo))從循環(huán)中進(jìn)入損傷部位活化為巨噬細(xì)胞，分泌多種因子擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。3．激光誘導(dǎo)后2wCNV形成，