Notch信號調(diào)控巨噬細胞參與心梗重塑的作用和分子機制研究.pdf

1、心肌梗死隨著其發(fā)病率和致死率的逐年攀升,已成為嚴重威脅國民身體健康的第一殺手。急性期心肌梗死主要的死亡原因是急性心衰竭,隨著醫(yī)療水平的進步,內(nèi)科藥物溶栓、介入支架和外科的搭橋手術(shù)使急性期心梗發(fā)展成急性心衰進而導致死亡的幾率大幅度下降。但隨著病情的進一步發(fā)展轉(zhuǎn)為慢性期。慢性期主要以心臟纖維化重塑為主,如果纖維重塑過度會引發(fā)慢性心衰導致死亡。然而,到目前為止預防和治療心臟纖維化重塑過度尚無好的方法。有研究表明,巨噬細胞極化在心梗后纖維化重塑

2、全程具有重要的調(diào)控作用。那么是否可以通過調(diào)控巨噬細胞極化實現(xiàn)對膠原纖維降解和生成的良性調(diào)控,進而成為預防和治療心梗后心室惡性纖維化重塑的新途徑呢?
　　目前,許多信號通路參與巨噬細胞的極化。RBP-JК介導的經(jīng)典Notch信號通路是進化上十分保守的信號通路,對細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡及組織重塑等過程起重要的調(diào)控作用。我們實驗室王耀春博士2010年在實體瘤的研究中首次發(fā)現(xiàn)Notch信號與巨噬細胞的極化密切相關(guān),阻斷RBP-JК介

3、導的Notch信號可以促進巨噬細胞向 M2型極化,而同一年熊思東教授組的研究報道在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中, Notch1通過調(diào)控巨噬細胞向M2b的極化而參與了其病理進程。2012年,曹雪濤院士研究組發(fā)現(xiàn),用γ分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路會促進TLR誘導的炎癥反應,并促進巨噬細胞向M1型極化,同年《Nature Immunol》上發(fā)表了Notch信號通路通過上調(diào)IRF8促進M1型極化的文章。這些研究均說明Notch信號通路對巨噬細胞的極化

4、起重要的調(diào)控作用。然而,RBP-JК介導的Notch信號通路在巨噬細胞參與組織損傷后重塑過程中是否也具有關(guān)鍵的調(diào)控作用尚無報道,是否能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化來調(diào)節(jié)心梗后心室重塑也尚不明確。
　　基于上述問題,本實驗首次利用在巨噬細胞中特異剔除Notch信號的小鼠對巨噬細胞在組織損傷重塑過程中是否起作用進行了探索,同時對其在心梗后重塑過程中的調(diào)控作用及其機制進行了深入分析,這些研究為尋找治療和預防心梗后惡性纖維化重塑的新策略提供了理

5、論依據(jù),具有潛在的臨床應用價值。
　　目的：
　　1.探索 RBP-JК介導的Notch信號通路在巨噬細胞參與組織損傷后重塑過程中的作用。
　　2.觀察心梗后阻斷巨噬細胞中的Notch信號通路對心梗區(qū)域及心臟內(nèi)、外單核/巨噬細胞的影響。
　　3.探尋Notch信號通路調(diào)控巨噬細胞參與心梗重塑過程中的分子機制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建巨噬細胞中剔除 RBP-JК小鼠,并依據(jù)實驗需要分為實驗組(RBP-

6、JК剔除小鼠)和對照組(RBP-JК野生小鼠或雜合小鼠)。
　　2.對12周左右小鼠實驗組(10只)和對照組(16只)進行高氏心梗模型的構(gòu)建,4周之后利用小動物超聲對兩組小鼠的心臟功能及左室體重比進行比較分析。
　　3.分離心梗后小鼠心臟和肺臟,稱重后對兩組小鼠心臟體重比和肺臟體重比進行比較分析。
　　4.通過心梗小鼠心臟的大體圖片及石蠟切片的Masson染色對兩組小鼠心梗面積和纖維化重塑程度進行比較分析。
　　

7、5.對8周左右小鼠實驗組(12只)和對照組(12只)建立四氯化碳誘導的組織損傷模型,10周之后分離肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及心臟,通過大體圖片、組織切片的Masson染色和天狼星紅染色對組織損傷程度和纖維化重塑的程度進行比較分析。
　　6.通過心臟石蠟切片的免疫熒光染色對兩組小鼠心梗區(qū)巨噬細胞數(shù)量及類型、細胞凋亡及新生血管數(shù)量進行比較分析。
　　7.通過ELISA對兩組小鼠非梗死區(qū)HYP含量進行比較分析。
　　8.通過

8、Q-PCR對兩組小鼠梗死區(qū)炎癥因子、抗炎因子及纖維化相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平進行比較分析。
　　9.采集心梗后兩組小鼠的血液并離心獲得上清,通過 ELISA對血清中炎癥因子(TNF-α,IL-6)及抗炎因子(IL-10)進行比較分析。
　　10.獲得心梗后兩組小鼠的血液、脾臟和骨髓,通過流式對心梗外組織中的單核/巨噬細胞進行比較分析。
　　11.采用LPS加INF-γ誘導原代培養(yǎng)骨髓源的巨噬細胞向炎癥相關(guān)M1型巨噬細胞極化,通

9、過Western blot、流式和ELISA對兩組小鼠炎癥相關(guān)因子的表達及相關(guān)調(diào)控通路NF-κB信號通路進行比較分析。
　　結(jié)果：
　　1.心梗4周后,兩組小鼠生存曲線無明顯區(qū)別。
　　2.心梗4周后,小動物超聲顯示:敲除小鼠射血分數(shù)(EF％)(54.04±7.293)高于對照組(36.03±4.034);左室短軸收縮率(FS%)(27.62±4.293)高于對照組(17.31±2.180);敲除小鼠左室舒張期前壁 L

10、VAWd(mm)(0.8613±0.07792)、后壁LVPWd(mm)(0.6676±0.01436)及室間隔厚度LVIWd(mm)(3.367±0.2837)薄于對照組(分別為0.6465±0.03634;0.7284±0.06317;4.382±0.1748);敲除小鼠左室舒張期容積LV Vol d(ul)(47.92±10.31)少于對照組(87.87±8.209)。
　　3.心梗4周后,敲除小鼠左室體重比、心臟體重比及肺

11、臟體重比均低于野生組。
　　4.心梗4周后,心臟大體圖片和組織切片MASSON染色均顯示心梗后敲除小鼠心臟梗死面積減少;此外,心臟 MASSON染色還顯示敲除心梗區(qū)心肌存活增多,梗死區(qū)域及非梗死區(qū)域纖維化重塑減輕。
　　5.在四氯化碳誘導的組織損傷模型中,10周后分離小鼠的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及心臟,通過大體圖片、Masson染色及天狼猩紅染色對兩組小鼠進行比較分析發(fā)現(xiàn),敲除小鼠肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及心臟損傷輕于對照組,

12、同時各個器官的纖維化重塑程度也輕于對照組。
　　6.心梗4周后,通過免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下對兩組小鼠進行比較分析發(fā)現(xiàn)心梗后敲除小鼠梗死區(qū)域巨噬細胞減少,主要以炎癥相關(guān)的巨噬細胞減少為主,抗炎相關(guān)的巨噬細胞變化不明顯,梗死區(qū)域細胞凋亡減少,心梗區(qū)域、交接區(qū)域和非梗死區(qū)域新生血管無明顯統(tǒng)計學差異。
　　7.心梗4周后,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)敲除小鼠血中炎癥相關(guān)因子(TNF-α,IL-6)和抗炎相關(guān)因子(IL-10)與對照

13、組相比較變化不明顯。
　　8.心梗4周后,大體圖片和脾臟體重比顯示敲除小鼠脾臟增大不明顯。
　　9.心梗4周后,流式細胞儀檢測:心梗后敲除小鼠血、骨髓及脾臟中炎癥相關(guān)(LY6CHigh CD11b+)和抗炎相關(guān)(LY6CLow CD11b+)的單核細胞減少。此外,敲除小鼠脾臟中單核細胞來源的巨噬細胞(CD11b+F4/80+)減少,且炎癥相關(guān)的巨噬細胞(F4/80+iNOS+)減少。
　　10.LPS+INF-γ刺激原

14、代培養(yǎng)巨噬細胞2小時后,通過共聚焦顯微鏡檢測:敲除小鼠P65入核減少,IκB降解減少。流式檢測:敲除小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α表達減少。
　　11.LPS+INF-γ刺激原代培養(yǎng)巨噬細胞24小時后,細胞培養(yǎng)液ELISA檢測:敲除小鼠巨噬細胞分泌炎癥相關(guān)因子(TNF-α,IL-6,IL-12)降低,抗炎相關(guān)因子(IL-10)升高。共聚焦顯微鏡檢測:敲除小鼠炎癥相關(guān)因子TNF-α表達減少,P65和P50表達降低,IκB降解降低。蛋白印

15、跡檢測:敲除小鼠巨噬細胞中CYLD表達升高, P65和P50表達降低,IκB降解降低。
　　結(jié)論：
　　1.以兩種不同形式的組織慢性損傷模型同時證明了巨噬細胞中RBP-JК介導的Notch信號通路與組織慢性損傷后重塑密切相關(guān)。阻斷巨噬細胞中的RBP-JК可以減輕組織損傷和纖維化重塑。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)巨噬細胞中的Notch信號通路與心梗后心臟功能的恢復密切相關(guān)。阻斷巨噬細胞中的Notch信號通路可以減輕心梗后心臟損傷,

16、抑制纖維化重塑有助于心臟功能的恢復,為改善心梗后心臟功能及治療和預防心梗后惡性纖維化重塑提供一個新的思路。
　　3.首次發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細胞中的Notch信號通路可以抑制梗死區(qū)域的巨噬細胞向炎癥相關(guān)M1型極化而對抗炎相關(guān)的M2型極化沒有影響,并且影響心梗以外其他組織(血液、骨髓及脾臟)中炎癥相關(guān)單核細胞生成,進而減少炎癥相關(guān)巨噬細胞的來源,為Notch信號通路在體內(nèi)調(diào)控巨噬細胞極化的機制提供了一個新的思考方向。
　　4.在體外實

17、驗中證明了阻斷巨噬細胞中的Notch信號可抑制P65及P50的表達,促進CYLD上調(diào)抑制IκB降解和P65入核,進而使NF-κB信號通路活化受阻,導致炎癥因子分泌減少。同時,我們還發(fā)現(xiàn)阻斷巨噬細胞中的Notch信號可以促進抗炎相關(guān)因子IL-10分泌,提示體外阻斷巨噬細胞中的Notch信號可抑制其向M1型極化,促進巨噬細胞向M2型極化。
　　總之,這些研究為尋找治療和預防心梗后惡性纖維化重塑的新策略提供了理論依據(jù),具有潛在的臨床應用