ConA誘導(dǎo)肝衰竭中肝臟巨噬細(xì)胞調(diào)控分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝衰竭是一類起病較急且病情嚴(yán)重的肝臟疾病，它會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的大量死亡，最終引起多個(gè)器官的功能失調(diào)和衰竭。它的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括直接的肝臟損傷和不同病原刺激所引起的免疫調(diào)節(jié)損傷兩部分。而固有免疫調(diào)節(jié)引起的損傷在肝衰竭中發(fā)生的很早，因此是肝衰竭發(fā)生的重要原因之一。肝臟巨噬細(xì)胞是一類定植于肝臟中的特殊巨噬細(xì)胞，它是固有免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的重要組成部分，在許多肝臟疾病所引起的肝臟炎癥中具有重要調(diào)節(jié)的作用。然而，肝衰

2、竭發(fā)病過(guò)程中，肝臟巨噬細(xì)胞的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明了。本課題旨在研究肝衰竭早期，肝臟巨噬細(xì)胞中免疫狀態(tài)改變對(duì)肝衰竭發(fā)病影響，闡明促炎因子IL-1β的產(chǎn)生原因及作用，探究肝臟巨噬細(xì)胞中相關(guān)microRNA分子對(duì)肝衰竭早期肝臟巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用，從而進(jìn)一步理解肝衰竭中固有免疫損傷調(diào)節(jié)的具體機(jī)制，為尋求有效治療方法提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞免疫狀態(tài)改變的影響和產(chǎn)生IL-1β的原因
　　1

3、.1肝臟巨噬細(xì)胞免疫狀態(tài)動(dòng)態(tài)變化:通過(guò)ConA處理建立小鼠肝衰竭模型，在ConA處理1，3，6小時(shí)后，分離出小鼠肝臟巨噬細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)M1型代表分子IL-1β，M2型代表分子Arg1、Mrc2的mRNA表達(dá)水平。
　　1.2 IL-1β的產(chǎn)生原因:在ConA處理1，3，6小時(shí)后，分離出小鼠肝臟巨噬細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)炎性小體分子AIM2的mRNA表達(dá)水平;Western blot檢測(cè)AIM2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。分離正常小鼠

4、的肝臟巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染AIM2-siRNA及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，ConA（5μg/ml，下同）刺激1，3，6小時(shí)后，ELISA檢測(cè)IL-1β的表達(dá)水平。
　　2.肝衰竭早期階段，相關(guān)microRNA分子調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞的機(jī)制研究
　　2.1篩選合適的microRNA:在ConA處理1，3，6小時(shí)后，分離出小鼠肝臟巨噬細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)microRNA-155和microRNA-223的表達(dá)水平。
　　2.2 microR

5、NA-223與IL-1β的關(guān)系:分離正常小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染microRNA-223模擬物和microRNA-223抑制子及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，ConA刺激1，3，6小時(shí)后，ELISA檢測(cè)IL-1β的表達(dá)水平
　　2.3 microRNA-223與AIM2的關(guān)系:分離正常小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染microRNA-223模擬物和microRNA-223抑制子及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，ConA刺激1，3，6小時(shí)后，RT-PCR檢測(cè)炎性小

6、體分子AIM2的mRNA表達(dá)水平;Westernblot檢測(cè)AIM2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　轉(zhuǎn)染AIM2-siRNA及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，ConA刺激1，3，6小時(shí)后，RT-PCR檢測(cè)microRNA-223的表達(dá)水平。
　　共轉(zhuǎn)染熒光報(bào)告質(zhì)粒，空質(zhì)粒和microRNA-223及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照，檢測(cè)熒光的強(qiáng)度值。
　　研究結(jié)果:
　　1.肝臟巨噬細(xì)胞免疫狀態(tài)動(dòng)態(tài)變化:
　　肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞活化后呈現(xiàn)

7、出免疫狀態(tài)的動(dòng)態(tài)改變。由促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)為抑炎狀態(tài)，最終又轉(zhuǎn)為促炎狀態(tài)的表現(xiàn)。
　　2.IL-1β的產(chǎn)生原因:
　　肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞內(nèi)的IL-1β的產(chǎn)生與炎性小體分子AIM2有關(guān)。AIM2的表達(dá)被siRNA抑制后，IL-1β的產(chǎn)生量明顯減少。
　　3.microRNA-223與IL-1β的關(guān)系:
　　肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞內(nèi)microRNA-223能抑制IL-1β的產(chǎn)生。MicroRNA-223過(guò)表達(dá)

8、后，IL-1β的產(chǎn)生明顯減少;microRNA-223被抑制后，IL-1β的產(chǎn)生明顯增多。
　　4.microRNA-223與AIM2的關(guān)系:
　　肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞內(nèi)microRNA-223能抑制AIM2的表達(dá)。MicroRNA-223過(guò)表達(dá)后，AIM2的表達(dá)明顯下降;microRNA-223被抑制后，AIM2的表達(dá)明顯升高。AIM2的表達(dá)被siRNA抑制后，microRNA-223的表達(dá)沒(méi)有變化。熒光報(bào)告系統(tǒng)檢

9、測(cè)結(jié)果顯示AIM2不是microRNA-223的直接靶點(diǎn)。
　　研究結(jié)論:
　　1.肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞活化后免疫狀態(tài)的改變，產(chǎn)生大量的促炎因子IL-1β影響肝衰竭的發(fā)生。
　　2.肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞IL-1β的產(chǎn)生與AIM2有關(guān)。
　　3.肝衰竭早期階段，肝臟巨噬細(xì)胞中microRNA-223能抑制肝臟巨噬細(xì)胞中AIM2的表達(dá)從而阻礙促炎因子IL-1β的產(chǎn)生并影響肝臟巨噬細(xì)胞活化后免疫狀態(tài)的改