LIM蛋白FHL1C-KyoT2抑制Notch信號及調(diào)控巨噬細胞極化的分子機制研究.pdf

1、轉化醫(yī)學（Translational Medicine)是21世紀國際醫(yī)學科學領域的親新概念，是一種打破單一地追求基礎研究成果或臨床療效的僵局，致力于使基礎研究與臨床應用通力合作，以患者為中心，提高整體醫(yī)療水平的新概念。隨著我國老齡化社會的到來，轉化醫(yī)學理念在老年醫(yī)學的教育和臨床工作中必將發(fā)揮更大的作用。
　　細胞是生命體結構形成和功能實現(xiàn)的承擔者。當細胞外的信號通過細胞膜傳遞至細胞內(nèi)時，細胞會依據(jù)所接收的信號激發(fā)一系列生物化學反

2、應，完成某種信號通路的轉導。Notch信號通路表達廣泛，屬于在進化上高度保守的單次跨膜受體蛋白，主要通過介導細胞之間的信息傳遞而參與調(diào)控細胞生物發(fā)育，繼而引起一系列生物學行為。Notch信號活化最早由臨近細胞表面的Notch配體和受體接觸開始，當Notch蛋白經(jīng)歷三次剪切后，胞內(nèi)片段N IC D被釋放入核，并與信號通路最關鍵分子一轉錄因子RBP-J結合而募集轉錄共激活復合物，啟動下游基因的表達。大量研究證明， Notch信號在細胞、組織

3、、器官的分化、發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。人類多種疾病，如遺傳病、腫瘤、老年病等的產(chǎn)生都與N otch通路組成分子的突變和表達異常密切相關，而轉錄因子RBP-J是介導Notch信號的關鍵轉錄因子。因而我們設想，靶向RBP-J介導的Notch通路的轉錄調(diào)控一定會在疾病的治療和轉歸過程中產(chǎn)生積極的指導作用。
　　國外研究發(fā)現(xiàn)：N otch信號通路的關鍵轉錄分子RBP-J可與 LIM結構域蛋白KyoT2(人FHL1C在小鼠中的同源物）

4、結合而募集多種轉錄共抑制分子，從而抑制RBP-J介導的Notch信號下游基因的轉錄，抑制Notch信號的活化。課題組前期的研究揭示:FHLlC/KyoT2發(fā)揮轉錄抑制是通過與RING1和HPC2相互作用，并與RBP-J形成復合物而實現(xiàn)的。然而，F(xiàn)HLlC/KyoT2分子缺少核定位相關信號，其入核調(diào)控各類分子的機制很有可能是通過其它間接方式完成，如：改變修飾方式，或者通過與其他核蛋白的相互作用實現(xiàn)。課題組前期為揭示FHL1C入核介導轉錄抑

5、制的機制，利用蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)：FHL1C可能與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白P亞基中的GNB2蛋白相互作用。進一步證實FHL1C與GNB2之間存在相互作用以及揭示其作用機制將有助于深入了解FHL1C對Notch信號抑制的分子機制。
　　巨噬細胞是機體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細胞，巨噬細胞不同的極化分型與老年病、代謝性疾病、腫瘤等多系統(tǒng)、多臟器疾病存在相關性，而極化狀態(tài)的失衡是引起一系列疾病發(fā)生的關鍵。因此，合理干預巨噬細胞極化的相關步驟，扭

6、轉表型失衡狀態(tài)，避免免疫相關性疾病的發(fā)生和指導治療具有實際的臨床應用價值。文獻和課題組前期在實體瘤中研究證明，N otch信號與巨噬細胞極化存在及其緊密的關系：Notch信號激活可促進巨噬細胞向M l型極化，發(fā)揮促炎、抗腫瘤的作用；剔除Notch信號關鍵分子RBP-J，促使巨噬細胞向M2型極化，發(fā)揮抗炎、促腫瘤的作用。但N otch信號調(diào)控巨噬細胞極化的詳細分子機制尚不清楚。因而，為了進一步揭示Notch信號調(diào)控巨噬細胞極化的分子機制，

7、我們在小鼠骨髓來源原代巨噬細胞中觀察了Notch信號轉錄抑制物KyoT2通過調(diào)控Notch活性而對巨噬細胞極化的影響，為靶向Notch信號調(diào)控巨噬細胞極化治療相關疾病奠定理論基礎。
　　為了更全面的闡明Notch信號抑制物FHLlC/KyoT2的生物功能，我們利用免疫共沉淀和哺乳動物雙雜交技術，從分子、細胞水平驗證FHL1C與其候選相互作用分子GNB2的關系，進而豐富FHL1C調(diào)控Notch信號通路的分子機制。為了觀察LIM結構域

8、蛋白KyoT2能否通過Notch調(diào)控巨噬細胞極化，我們利用分子生物學方法和技術，觀察沉默KyoT2后Notch信號通路及巨噬細胞極化狀態(tài)的改變，以期進一步完善Notch信號調(diào)控巨噬細胞極化的作用和機制，為將來靶向干預Notch信號通路及巨噬細胞免疫應答提供新思路和新策略。本課題分兩部分完成，具體如下：
　　1、LIM結構域蛋白FHL1C與GNB2相互作用驗證
　　1)通過分子克隆技術成功構建GNB2的真核表達載體pCMV-V

9、P16-GNB2和pCMV-Flag-GNB2,轉化擴增新構建載體及實驗室保存的FHL1C的真核表達載體pCMV-GAL4-DBD-FHLlC和 pCMV-myc-FHLIC。酶切結果符合相對應條帶大小，DNA測序正確。
　　2)利用瞬時轉染及雙熒光素酶報告基因檢測方法進行哺乳動物雙雜交實驗，結果提示相對于陽性對照組，F(xiàn)HL1C和GNB2實驗組不能激活下游報告基因Luciferase的表達，F(xiàn)HL1C和GNB2間不具有物理相互作用

10、。
　　3)免疫共沉淀實驗檢測細胞裂解液中FHL1C與GNB2是否形成共沉淀復合物。Western blot結果顯示:實驗組中GNB2與FHL1C未形成共沉淀復合物，提示FHL1C和 GNB2不存在生理上相互作用。
　　2、LIM結構域蛋白KyoT2通過Notch信號調(diào)控巨噬細胞極化的初步研究
　　1)誘導分化骨髓單核細胞6天，通過流式細胞術鑒定CDllb/F4/80雙陽性巨噬細胞數(shù)量，確定骨髓單核細胞誘導分化成巨噬細

11、胞的效率。采用LPS+IFN-Y誘導Ml型巨噬細胞、IL-4誘導M2型巨噬細胞，通過qRT-PCR檢測巨噬細胞極化標志物的表達(P＜0.01)，確定巨噬細胞極化誘導成功。
　　2)通過PCR技術檢測不同極化狀態(tài)下小鼠巨噬細胞中KyoT2的表達。采用siRNA技術沉默巨噬細胞中KyoT2基因的同時，巨噬細胞中Notch信號下游基因Hesl、Heyl表達被激活(P＜0.05)，Notch信號活化。
　　3)沉默巨噬細胞不同表型中

12、KyoT2表達后，與對照組相比，巨噬細胞M l型標志性分子表達無顯著改變，M2型標志性分子表達降低(P＜0.05)。提示：KyoT2促進巨噬細胞向M2型極化。
　　綜上所述，本課題豐富了LIM蛋白FHLlC/KyoT2抑制Notch信號及調(diào)控巨噬細胞極化的分子機制。主要研究結論為：
　　1、LIM結構域蛋白FHL1C與GNB2之間未發(fā)現(xiàn)明顯的物理和生理上相互作用。質(zhì)譜分析的FHL1C與其他候選分子的相互作用的研究仍需要繼續(xù)進