腺病毒介導(dǎo)胰島素樣生長因子1基因?qū)︽滊遄艟刂麓笫笠葝uβ細(xì)胞損害的保護(hù)性作用.pdf

1、第一部分
　　 目的：構(gòu)建含有鼠胰島素樣生長因子-1(IGF-1)基因的重組腺病毒，并轉(zhuǎn)染鼠胰島β細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株—RINm5F細(xì)胞，研究rIGF-1對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠胰島β細(xì)胞損害的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為基因治療糖尿病提供理論依據(jù)。
　　 方法：從大鼠肝臟組織提取目的基因RNA，RT-PCR轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增產(chǎn)物DNA，并進(jìn)行純化。分別用限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ和EcoRV雙酶切消化目的基因片段和穿梭載體pAdTr

2、ack-CMV，定向亞克隆到pAdTrack-CMV質(zhì)粒上，1×TSS法轉(zhuǎn)化E.coliDH10B菌，篩選重組pAdTrack-CMV-rIGF-1質(zhì)粒。在E.coliBJ5183菌中構(gòu)建重組子。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。同樣方法包裝擴(kuò)增不含目的基因的空腺病毒載體，作為病毒載體對照?？焖傧俨《靖腥拘缘味葯z測試劑盒測定病毒滴度。重組腺病毒轉(zhuǎn)染RINm5F細(xì)胞，ELISA和Westemblotting檢測rIGF-1表達(dá)；STZ誘導(dǎo)細(xì)

3、胞破壞，檢測培養(yǎng)上清中NO水平，胰島素釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能測定，流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡，四甲基偶氮唑鹽法檢測細(xì)胞存活率。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：目的基因RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到406bp特異性rIGF-1電泳條帶，并成功構(gòu)建了含有rIGF-1基因的重組腺病毒，病毒滴度為1.0×109pfu/ml，腺病毒空載體滴度為8.0×108pfu/ml。rIGF-1在轉(zhuǎn)染RINm5F細(xì)胞16h后可

4、觀察到細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功，rIGF-1有效表達(dá)。STZ誘導(dǎo)后，正常組和Ad-eGFP組胰島素釋放量較對照組明顯降低(P<0.01)，而Ad-rIGF-ì預(yù)處理組與對照組胰島素釋放量差異無顯著性；正常組和Ad-eGFP組NO產(chǎn)量明顯高于對照組（P<0.05），而Ad-rIGF-1預(yù)處理組能明顯抑制NO的產(chǎn)生，與對照組差異無顯著性；正常組和Ad-eGFP組與對照組相比細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)，經(jīng)Ad-rIGF-1預(yù)處理組

5、細(xì)胞則可抑制STZ致細(xì)胞凋亡作用；正常組(P<0.01)、Ad-eGFP組(P<0.05)細(xì)胞存活率顯著降低，而經(jīng)Ad-rIGF-1預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞則可抵抗STZ的細(xì)胞毒性作用。
　　 結(jié)論：胰島β細(xì)胞局部表達(dá)IGF-1能夠保護(hù)細(xì)胞功能，抑制NO產(chǎn)生，使胰島β細(xì)胞免受誘導(dǎo)凋亡因子的損害，提高細(xì)胞存活率，具有防治1型糖尿病的作用。STZ誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡可能與NO介導(dǎo)有關(guān)。
　　 第二部分
　　 目的：通過將Ad-rIG

6、F-1基因以三種不同途徑(肌肉注射、腹腔注射、胰島被膜下注射)導(dǎo)入SD大鼠體內(nèi)，觀察不同組別大鼠糖尿病的發(fā)病情況，觀察Ad-rIGF-1基因?qū)TZ誘發(fā)SD大鼠糖尿病的保護(hù)作用，以及比較3種不同注射途徑體內(nèi)表達(dá)的效果，為rIGF-1進(jìn)行基因防治糖尿病創(chuàng)造條件。
　　 方法：4-6周齡SD雄性大鼠90只，隨機(jī)分為：A糖尿病對照組，B空白對照組，C腺病毒空載體對照組，D肌肉注射Ad-rIGF-1組，E腹腔注射Ad-rIGF-1組，F(xiàn)

7、胰腺被膜下注射Ad-rIGF-1組，每組各15只。A組、B組不做任何處理，C組注射含Ad-eGFP的重組腺病毒液0.1mL(8.O×107pfu)，D、E、F組注射含Ad-rIGF-1的重組腺病毒液0.1mL(1.0×108pfu)。1周后A組及D、E、F組大鼠分別禁食12h后給予腹腔注射STZ50mg/kg促發(fā)糖尿病，每周測定體質(zhì)量、血糖，血糖≥16.7mmol/L并維持1周者確定為發(fā)生糖尿病。成模5周后處死大鼠，取胰腺做病理切片HE

8、染色觀察胰腺炎癥浸潤程度，SABC免疫組化試劑盒檢測大鼠胰腺組織中IGF-1局部表達(dá)程度；取下腔靜脈血1ml，EI．ISA試劑盒檢測血清IGF—l及胰島素含量。采用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：A、D、E、F組大鼠腹腔注射STZ2天后出現(xiàn)明顯的多飲多尿現(xiàn)象，糖尿病成模率分別為A組100％，D組61.5％，E組60％，F(xiàn)組66.7％。D、E、F組糖尿病發(fā)病率明顯低于A組，但D、E、F各組之間無明顯差異；

9、胰腺切片HE染色顯示D、E、F組胰腺炎程度較A組輕，但明顯高于B、C組，且D、E、F各組之間胰島炎情況無明顯差別:免疫組化顯示D、E、F組IGF-1胰島局部高表達(dá)，且D、E、F三組之間無明顯差異，但明顯高于A、B、C組；ELISA法測得D、E、F組血清胰島素水平較A組高，且D、E、F三組之間無明顯差異，與B、C組相比亦差異亦不明顯；血清IGF-1水平各組之間無明顯差異。
　　 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的IGF-1基因?qū)TZ誘導(dǎo)的SD大