慢病毒載體介導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1基因修飾肌源性干細(xì)胞移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討慢病毒載體介導(dǎo)的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）基因修飾的肌源性干細(xì)胞（MDSCs）移植對(duì)雌性壓力性尿失禁大鼠模型的作用及可能機(jī)制，為細(xì)胞移植策略治療女性壓力性尿失禁提供新的理論依據(jù)。
　　方法：1、體外原代MDSCs的分離、純化、分化和鑒定。取Wistar大鼠腓腸肌，機(jī)械法和酶消化法后，采用改良差速貼壁法純化大鼠原代MDSCs，通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)和分化情況，采用流式細(xì)胞儀術(shù)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)、免疫細(xì)

2、胞化學(xué)對(duì)P3-MDSCs進(jìn)行表型鑒定，同時(shí)對(duì)分化培養(yǎng)的P3-MDSCs進(jìn)行MyHC蛋白檢測(cè)。2、采用體外重組（in-fusion）技術(shù)，以攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介，構(gòu)建攜帶IGF-1基因重組的慢病毒表達(dá)載體（pGC-FU-IGF-1），通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶切和測(cè)序的方式鑒定所構(gòu)建的載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以熒光顯微鏡觀察綠色熒光，以Western blot檢測(cè)GFP蛋白

3、的表達(dá)，以實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RT-QPCR）檢測(cè)慢病毒的滴度。將攜帶有IGF-1＆eGFP融合基因的慢病毒和僅攜帶eGFP的慢病毒感染大鼠MDSCs（分別為IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組），通過熒光表達(dá)情況以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）結(jié)果確定最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）。3、取最佳MOI慢病毒感染MDSCs，待IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組達(dá)到90％融合后，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激微環(huán)境，體外建立過氧化氫（H2

4、O2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，MTS法檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間的H2O2干預(yù)對(duì)MDSCs活性的影響，并通過流式、DNA ladder探討H2O2對(duì)MDSCs凋亡的影響；Western blot檢測(cè)MDSCs內(nèi)抗凋亡相關(guān)蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl與凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP的表達(dá)情況，探討IGF-1基因修飾的MDSCs抑制細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。4、采用雙側(cè)陰部神經(jīng)橫斷法（PNT）建立雌性壓力性尿失禁大鼠模型，6

5、0只成年雌性大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組（S組）、溶劑對(duì)照組（PBS組）、空病毒感染的MDSCs移植組（GFP/MDSCs組）和IGF-1基因修飾的MDSCs移植組（IGF-1/MDSCs組），以1×106個(gè)/只細(xì)胞數(shù)注入尿道距膀胱約0.5cm處，每組再按治療后1、2、4周分為3個(gè)亞組（每組5只）。采用尿動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)造模成功與否，并評(píng)價(jià)注射治療1、2、4周后尿道閉合功能情況。注射治療1周后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡評(píng)價(jià)移植細(xì)胞存活情況。注射治療

6、4周后，免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)近端尿道毛細(xì)血管生成情況；伊紅-蘇木素（HE）及Masson染色評(píng)價(jià)近端尿道組織病理學(xué)改變；多重免疫熒光技術(shù)評(píng)價(jià)移植細(xì)胞的分化情況。在注射治療的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1、所分離培養(yǎng)的MDSCs具有低粘附性、小圓形、折光性強(qiáng)的生物學(xué)特性，可以形成肌管，細(xì)胞表型鑒定為Sca-l（＋）、CD

7、34（＋）、CD45（－）和desmin（＋），符合MDSCs的特征。2、所構(gòu)建的IGF-1＆eGFP重組慢病毒載體，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定完全正確，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后能夠正常表達(dá)，測(cè)得病毒滴度為2×108TU/ml。慢病毒感染MDSCs后，隨著MOI值的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并伴隨IGF-1分泌水平顯著增加（p﹤0.01）。3、低溶度（﹤200 uM）、短時(shí)間的H2O2（﹤0.5h）干預(yù)對(duì)MDSCs的活性無明顯影響（p＞0.05）

8、，隨著H2O2濃度的增加，作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MDSCs的活性顯著下降（p﹤0.01），其中，GFP/MDSCs組下降更為明顯（p﹤0.01）。通過DNA ladder凝膠電泳以及流式細(xì)胞儀雙染檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)H2O2能夠誘導(dǎo)MDSCs caspase酶依賴性凋亡，而IGF-1能夠拮抗H2O2作用，上調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白P-AKT、NFκB、Bcl-2以及Bcl-xl的表達(dá)（p﹤0.05），降低caspase-3、PARP的水解程度（p﹤0.01

9、）。4、成功構(gòu)建壓力性尿失禁大鼠模型。細(xì)胞注射治療1周后，IGF-1/MDSCs組的細(xì)胞存活率顯著高于GFP/MDSCs組（p﹤0.01），4周后，移植的細(xì)胞可以分化為MyHC，其中IGF-1/MDSCs組的細(xì)胞分化強(qiáng)度強(qiáng)于GFP/MDSCs組。IGF-1/MDSCs組和GFP/MDSCs組在細(xì)胞治療1、2、4周后無論是膀胱最大容量（MBC）還是腹壓漏尿點(diǎn)壓力（ALPP）均顯著高于PBS組（p﹤0.01），低于假手術(shù)組（p＞0.05），

10、其中IGF-1/MDSC組略高于GFP/MDSCs組（p＞0.05）。治療4周后，IGF-1/MDSCs組新生的毛細(xì)血管密度顯著高于GFP/MDSCs組（p﹤0.01），后者又高于PBS組及S組（p﹤0.01）。細(xì)胞治療的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IGF-1/MDSCs組的IGF-1和VEGF蛋白表達(dá)量與各組比較顯著升高（p﹤0.01），而GFP/MDSCs組在細(xì)胞治療1、2周后，明顯高于S組及PBS組（p﹤0.01），4周后，降至正常水平（p＞0.

11、05）。組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：IGF-1/ MDSCs組有較多新生血管及肌纖維形成，GFP/MDSCs組可見部分新生肌纖維和少許新生血管，PBS組可見尿道平滑肌、橫紋肌層變性、萎縮，血管減少。定量肌/膠原比率發(fā)現(xiàn)：S組﹥IGF-1/MDSCs組﹥GFP/MDSCs組﹥PBS組（p﹤0.05）。
　　結(jié)論：本研究可以從Wistar大鼠中成功分離出純度較高的MDSCs；成功構(gòu)建IGF-1＆eGFP融合基因重組慢病毒表達(dá)載體，并能夠安全有