L型鈣離子通道阻滯劑貝尼地平對(duì)C57-BL6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：
　　貝尼地平作為臨床上常用的降血壓藥物，其主要機(jī)制是通過調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞上的L型鈣離子通道的開閉，進(jìn)而調(diào)控平滑肌的收縮舒張，最終調(diào)控全身血壓。作為抗高血壓的常用藥物，貝尼地平具有持續(xù)干預(yù)的潛力。此外，目前貝尼地平對(duì)骨代謝的在體作用仍不明了，因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察貝尼地平對(duì)BMSC的成骨分化影響，以及貝尼地平灌胃去卵巢C57/BL骨質(zhì)疏松模型小鼠來探討鈣離子通道阻滯劑對(duì)骨代謝的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.材

2、料:取原代BMSCs所用的雌性4周大C57/BL6小鼠，體重10～15g，購至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:(1)主要儀器:倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，TE2000-U)，(2)主要試劑:一抗Runx2（CST公司），一抗OCN（CST公司），一抗GAPDH（CST公司），一抗β-catenin（CST公司），一抗LRP5（CST公司），ALP染色試劑盒（碧云天生物試劑公司），Caspase-8比色測定工具包（凱基生物

3、公司），貝尼地平（Sigma公司），α-MEM（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司）。
　　2.BMSCs的提取與培養(yǎng)
　　小鼠寰樞椎脫臼處死后75％酒精浸泡消毒5分鐘，在超凈臺(tái)中用眼科剪和眼科鑷剝開小鼠皮膚，從髖臼關(guān)節(jié)處取下小鼠雙下肢，PBS清洗掉粘連毛發(fā)，剝離附屬肌肉等軟組織整理出股骨，浸泡于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，用一套新的滅菌眼科剪和眼科鑷剪開股骨雙側(cè)骨端暴露骨髓腔，用1 ML注射器吸取10％FBS的完全

4、培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)并兩端交換沖洗，待骨頭發(fā)白后將含有骨髓的完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至干凈的15 ML離心管，800 r/min低速離心5分鐘，骨髓重懸后轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中5％的CO2下37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基3天更換1次。
　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的分組與處理
　　取第3代生長良好的小鼠BMSCs按1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞融合率達(dá)到90％以上時(shí)，將細(xì)胞分為2組，對(duì)照組:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng);貝尼地平處理組:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下

5、分別以1、10和100μmol/L貝尼地平培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基各成分比例為100 nmol/L的地塞米松，50μg/ml的維生素C磷酸酯，10 mM/L的β-甘油磷酸鈉。藥物連續(xù)處理14天，3天更換1次培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。
　　4.CCK8檢測貝尼地平對(duì)BMSCs的細(xì)胞毒性
　　第3代BMSCs種于96孔板中，細(xì)胞的種植密度為1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)2天后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加藥處理，加入貝尼地平濃度分別為0.1、1、

6、10、100和1000μmol/L，加藥處理1天，使用Caspase-8比色測定工具包(CCK8)進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性檢測。每孔加入10μL的CCK8溶液和90μL的α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用酶標(biāo)儀測量各孔吸光度（optical density, OD），CCK8溶液吸收波長為450 nm。
　　5.ALP染色實(shí)驗(yàn)
　　第3代BMSCs種于6孔板中，細(xì)胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平（1～100μmol/L）處理14天后，對(duì)細(xì)胞行ALP

7、染色。具體步驟為:洗去細(xì)胞培養(yǎng)基，使用無菌PBS輕柔沖洗2次，每孔加入2 ml的4％多聚甲醛室溫固定20分鐘;PBS沖洗3次，每次3分鐘，洗掉多余多聚甲醛;按照使用說明書配制ALP染液，現(xiàn)配現(xiàn)用，配好ALP染液避光保存;每孔細(xì)胞加入ALP染液1 ML避光37℃孵育半小時(shí);PBS沖洗3遍，每遍3分鐘，終止染色。光鏡下拍照，Image-Pro Plussoftware（IPP，美國）軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。
　　6.Western blo

8、tting檢測Runx2、OCN、GAPDH、β-catenin和LRP5的表達(dá)水平
　　對(duì)細(xì)胞成骨誘導(dǎo)并加入貝尼地平（1～100μmol/L）處理14天后，在冰上用蛋白裂解緩沖液裂解細(xì)胞，收集蛋白，樣品金屬浴96℃處理10分鐘，10000 r/min高速離心1分鐘，取上清，-20℃長期儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｃ織l泳道上樣30μg蛋白，用體積分?jǐn)?shù)(V/V)為10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳60分鐘，將凝膠中蛋白電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉常溫封

9、閉1小時(shí)后分別加入一抗(1∶2000)冰箱4℃過夜孵育，室溫TBST溶液清洗3遍，每遍5分鐘，二抗(1∶3000)常溫孵育1小時(shí)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光試劑顯色攝像。條帶用Image J軟件分析，測定灰度值。目的條帶與對(duì)應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.BD對(duì)BMSCs的細(xì)胞毒性影響
　　加藥處理1天后，對(duì)細(xì)胞行CCK8檢測，結(jié)果提示BD濃度在1～100.μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞均不會(huì)出現(xiàn)毒性

10、作用(p＞0.05)，各實(shí)驗(yàn)組（1～100μmol/L）CCK8結(jié)果和對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05，圖1，表1）。
　　2.BD對(duì)BMSCs的ALP表達(dá)影響
　　細(xì)胞處理14天后，行ALP染色，光鏡下拍照用IPP軟件計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。對(duì)照組:88.93183±13.84093，1μmol/L組:120.2671±24.90133，10μmol/L組:133.6373±20.98523，100μmol/L組:174.4

11、387±15.34316，各組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖2，表1），隨著BD濃度的增加，ALP陽性細(xì)胞數(shù)相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　3.BD對(duì)BMSCs的Runx2和OCN表達(dá)影響
　　細(xì)胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測Runx2表達(dá)量，對(duì)照組:1.054064±0.1719727，1μmol/L組:1.634447±0.1609285，10μmol/L組:2.116751±0.

12、2348296，100μmol/L組:2.924276±0.1659721，各組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖3，表1），隨著BD濃度的增加，Runx2表達(dá)相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.BD對(duì)股骨下段生長板周圍骨小梁的組織學(xué)影響
　　股骨下段行HE染色（圖1）發(fā)現(xiàn)，BD能明顯抑制由于去卵巢引起的骨質(zhì)疏松。和單純?nèi)ヂ殉步M（圖1，表1）小鼠的股骨下段生長板周圍骨小梁相比，去卵巢加藥組小

13、鼠的骨小梁數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但仍然低于假手術(shù)組小鼠（圖1，表1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.BD對(duì)股骨下段骨代謝參數(shù)的影響
　　股骨下段顯微CT掃描（圖2）發(fā)現(xiàn)，和去卵巢加藥組小鼠（圖2，表1）相比，去卵巢組小鼠的BMD、Tb.Th、Tb.N均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而各組中假手術(shù)組（圖2，表1）的BMD、Tb.Th和Tb.N最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

14、p＜0.05)。
　　6.BD對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路影響
　　細(xì)胞處理14天后行蛋白免疫印跡檢測β-catenin表達(dá)量，對(duì)照組:1.014551±0.0531498，1μmol/L組:2.090139±0.1359573，10μmol/L組:3.444125±0.4555160，100μmol/L組:4.381943±0.4081259，各組組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖4，表1），隨著BD濃度

15、的增加，β-catenin表達(dá)相應(yīng)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究首先通過酶標(biāo)儀法檢測貝尼地平對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的貝尼地平濃度范圍內(nèi)（1～100μmol/L）未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)毒性反應(yīng)(p＞0.05)。
　　2.貝尼地平對(duì)成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用。貝尼地平通過促進(jìn)成骨細(xì)胞中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化進(jìn)程。β-c

16、atenin和LRP5作為WNT/β-catenin信號(hào)通路內(nèi)關(guān)鍵正性調(diào)控蛋白，其表達(dá)量的上調(diào)提示W(wǎng)NT/β-catenin信號(hào)通路強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，從信號(hào)通路方面闡述貝尼地平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　3.本驗(yàn)通過去卵巢模仿絕經(jīng)期后婦女骨質(zhì)疏松模型，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)環(huán)境下，貝尼地平具有對(duì)抗雌激素水平下降的骨質(zhì)疏松作用。本課題對(duì)股骨下段石蠟切片進(jìn)行了成骨關(guān)鍵蛋白OCN和重要轉(zhuǎn)錄因子RUNX2免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測，

17、發(fā)現(xiàn)貝尼地平體內(nèi)通過成骨重要轉(zhuǎn)錄因子RUNX2促進(jìn)成骨，在分子生物學(xué)水平上揭示了貝尼地平促進(jìn)成骨的機(jī)制。
　　4.貝尼地平作為臨床上常用的心血管藥物，其降血壓特性已得到廣泛運(yùn)用，國外已有部分研究報(bào)道貝尼地平對(duì)成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。在此背景下，本研究以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為研究切入點(diǎn)，從成骨細(xì)胞的祖細(xì)胞水平在體外環(huán)境下探討貝尼地平對(duì)骨代謝的具體作用，并闡述了本過程的信號(hào)通路機(jī)制，為臨床上貝尼地平的全新運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。臨床上骨質(zhì)疏松癥作為骨