防風(fēng)組織培養(yǎng)及其發(fā)根體系建立方法的研究.pdf

1、本研究采用防風(fēng)種子作為外植體，獲得無菌苗，采用正交設(shè)計，篩選防風(fēng)組織培養(yǎng)各階段的最適培養(yǎng)基，研究了(1)防風(fēng)(Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.)的組織培養(yǎng)及植株再生體系。(2)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的生理生化法檢測及分子生物學(xué)鑒定、生物活力大小比較。(3)發(fā)根農(nóng)桿菌R1000<'1>對防風(fēng)遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究及發(fā)根體系的建立。結(jié)果如下： 在無菌

2、系建立時采用種子作為外植體，剝?nèi)シN皮，紙橋法(1/2MS)播種，污染率可降至13.3％，出芽時間縮短到7d，出芽率達(dá)到65.2％(自然情況下防風(fēng)出苗僅為50％，出芽時間40-60d不等)，出芽率提高了15.2％，出芽時間提前了30-50d；防風(fēng)葉片外植體在MS+2,4-D0.6+6-BA0.5(單位mg/L，下同)的培養(yǎng)基上7d即可見愈傷產(chǎn)生，出愈率達(dá)100％，較莖段、根、下胚軸外植體出愈率高，且愈傷組織塊大，生長旺盛：愈傷組織增殖的最

3、佳培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0+NAA0.6，30d后增殖倍數(shù)達(dá)到13.68倍，6-BA、NAA對愈傷組織增殖作用達(dá)到極顯著水平。KT對愈傷組織增殖作用不顯著；MS+NAA0.6+KT0.5+6-BA1.0是適合防風(fēng)愈傷組織芽分化的最佳培養(yǎng)基，芽分化率達(dá)到70.0％；不定芽在MS+NAA0.4培養(yǎng)基上產(chǎn)生的根白色、較粗壯，生根率達(dá)100％，當(dāng)根長至3～4cm、苗高5 cm左右時即可進行煉苗移栽。 生理生化法檢測供試的7個菌株，

4、R1025、R1601、R1000<'1>為生物Ⅱ型發(fā)根農(nóng)桿菌，與PCR檢測結(jié)果(R1000<'1>、R1025、R1601在540bp、770 bp附近有明顯條帶)相一致。YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)15h時，菌株密度(OD600)大小依次為R160l>R1000>L,BA9402>ATCCl5834>R1025>R1000<'1>>A<,4>。利用黃瓜剛展開子葉測定供試菌株的遺傳轉(zhuǎn)化活力，結(jié)果顯示R1000<'1>的遺傳轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到59

5、.0％，外植體生根數(shù)平均4.21條。除菌抗生素的選擇以Cef400mg/L為宜。 防風(fēng)發(fā)根誘導(dǎo)適宜外植體為幼葉，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基采用MS+2,4-D0.6+6-BA0.5+AS30，侵染前超聲波處理適宜時間為4s，侵染后共培養(yǎng)適宜天數(shù)為2d，發(fā)狀根誘導(dǎo)率可達(dá)62.9％。將除至無菌的防風(fēng)發(fā)狀根用MS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，測定生長曲線，在5～20d生長很快，隨著培養(yǎng)時間延長，35d以后，發(fā)狀根褐化嚴(yán)重，至35～40d發(fā)根生長進入平臺期，增長緩