缺乏D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶對(duì)分枝桿菌生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)的影響.pdf

1、本論文以恥垢分枝桿菌(Atycobacterium smegmatis，Sm)mc<'2>155 菌株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ骄猛粗亟M方法建立mc<'2>155 rmlA基因敲除菌株。通過(guò)測(cè)定rmlA基因敲除菌株的生長(zhǎng)曲線，確定rmlA基因是否為分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因。在此基礎(chǔ)上，研究RmlA酶缺乏時(shí)rmlA基因敲除菌株細(xì)胞形態(tài)的改變，和在缺乏RmlA酶的情況下 rmlA基因敲除菌株蛋白質(zhì)譜的變化。研究結(jié)果將為參與dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄

2、糖-1．磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo)提供更有力的證掘。本文獲得以下結(jié)果： 1．條件性復(fù)制質(zhì)粒 pPR27-xylE-Sm rmlA∶∶Kan<'R>的構(gòu)建： 根據(jù) Tb RmlA的氨基酸序列，對(duì)TIGR 的恥垢分枝桿菌mc<'2>155菌株基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，獲得mc<'2>155的rmlA和啟動(dòng)子(上游約500 bp)序列。從mc<'2>155基因組中PCR擴(kuò)增該基因及其啟動(dòng)子序列，克隆到pMD1

3、8-T 克隆質(zhì)粒，用BcaBEST Primer M13-47、RV-M對(duì)質(zhì)粒上攜帶的Sm rmlA基因及其啟動(dòng)子序列進(jìn)行DNA測(cè)序，并與已知的Sm rmlA基因及其啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的是正確的Sm rmlA基因。 用BamHI酶切pUC4K質(zhì)粒獲得Kan抗性基因(Kan<'R>)，用Klenow補(bǔ)平Kan<'K>基因的兩端并克隆到pMD18-Sm rmlA 質(zhì)粒中SmrmlA上的StuI位點(diǎn)，產(chǎn)生Sm rm

4、lA∶∶Kan<'R>突變基因。再將SmrmlA∶∶Kan<'R>突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒，構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm rmlA∶∶Kan<'K>。pPR27-xylE攜帶溫度敏感型復(fù)制子，使質(zhì)粒在允許溫度(30℃)條件下可以復(fù)制，在非允許溫度(42℃)條件下不能復(fù)制。pPR27-xylE還攜帶xylE基因和負(fù)選擇標(biāo)記sacB基因。 2．營(yíng)救質(zhì)粒pCG76-Tb rmlA的構(gòu)建： 從結(jié)核

5、分枝桿菌H37Rv基因組中PCR擴(kuò)增Tb rmlA基因，克隆到pMD18-T 克隆質(zhì)粒，測(cè)序與比對(duì)結(jié)果表明PCR擴(kuò)增的是正確的TbrmlA基因。用NdeI和XhoI酶切質(zhì)粒pMD18-Tb rmlA，獲得Tb rmlA基因，克隆到pET23b-Phsp60 質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建出pET23b-Phsp60-Tb rmlA質(zhì)粒。再經(jīng)XhoI酶切、Klenow補(bǔ)平和XbaI酶切獲得Phsp60-Tb rmlA片段。其中的Phsp60是來(lái)源于

6、分枝桿菌BCG熱休克蛋白60的啟動(dòng)子。將Phsp60-Tb rmlA克隆到pCG76質(zhì)粒，構(gòu)建出pCG76-Tb rmlA營(yíng)救質(zhì)粒。由于pCG76不攜帶用于目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子，目的基因Tb rmlA的表達(dá)由Phsp60啟動(dòng)子所控制。此外，pCG76質(zhì)粒也攜帶溫度敏感型復(fù)制子，使質(zhì)粒在30℃條件下可以復(fù)制，在42℃條件下不能復(fù)制。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)溫度使pCG76-Tb rmlA營(yíng)救質(zhì)補(bǔ)償或不補(bǔ)償mc<'2>155 Sm rmlA基因敲

7、除菌株中Sm rmlA∶Kan<'K>突變基因的功能。 3．第一次同源重組突變菌株mc<'2>155 M-1 的篩選： 將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm rmlA::Kan<'R>電轉(zhuǎn)化到mc<'2>155感受念細(xì)胞中，由于pPR27-xylE-Sm rmlA::Kan<'R>在42°C不能復(fù)制，SmrmlA::Kan<'R>與mc<'2>155基因組中的Sm rmlA發(fā)生同源重組，使SmrmlA::Kan<'

8、R> 以及sacB基因和xylE基因整合到mc<'2>155基因組中。用Sm rmlA探針對(duì) SmaI酶切的 7個(gè)黃色菌落基因組 DNA進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果顯示發(fā)生第一次同源重組的mc<'2>155 M-1突變菌株具有預(yù)期的雜交條帶(3.24 kb，7.72 kb和8.07 kb)。 4.第二次同源重組突變菌株mc<'2> 155 M-2(Sm rmlA基因敲除)的篩選： 將pCG76-Tb rmlA營(yíng)救質(zhì)

9、粒電轉(zhuǎn)化到mc<'2>155M-1感受態(tài)細(xì)胞中，用含10﹪蔗糖的選擇性LB瓊脂培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc<'2>155M-1，由于條件復(fù)制質(zhì)粒的sacB基因和xylE基因也被整合到mc<'2>155M-1基因組中，sacB基因的表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)evansucrase水解蔗糖，產(chǎn)生有害細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)，引起mc<'2>155M-1死亡，所以在這種選擇壓力下，mc<'2>155 M-1基因組中的Sm rmlA::Kan<'R>與Sm rmlA

10、發(fā)生第二次同源重組，將Sm rmlA基因、scaB基因以及xylE基因從mc<'2> 155 M-1基因組中刪除并被核酸酶水解，基因組中只存在Sm rmlA::Kan<'R>。如果SmrmlA為分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因，營(yíng)救質(zhì)粒上的Tb rmlA基因必須在mc<'2>155 M-2突變菌株中表達(dá)出Tb RmlA蛋白質(zhì)以補(bǔ)償Sm rmlA::Kan<'R>的功能。用Southern印跡方法篩選出mc<'2>155 M-2突變菌株，即Smrml

11、A基因敲除菌株。 5.生長(zhǎng)曲線的測(cè)定測(cè)定mc<'2> 155 M-2突變菌株在3°C和42°C的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該突變菌株在30°C可以生長(zhǎng)，但在42°C不生長(zhǎng)，說(shuō)明rmlA基因是分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因。 在隨后的溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中，讓mc<'2>155 M-2突變菌株在營(yíng)救質(zhì)粒容許的30°C生長(zhǎng)20小時(shí)，使之表達(dá)一定量Tb RmlA蛋白后，提高溫度至，42°C，使pCG76-Tb rmlA不能復(fù)制，影響Tb RmlA蛋白的

12、表達(dá)。在Tb RmlA逐漸缺乏的情況下，測(cè)定mc<'2>155 M-2突變菌株的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示mc<'2> 155 M-2突變菌株可以在42°C繼續(xù)增殖1-2天，第三天以后逐漸有細(xì)菌死亡，菌量減少。進(jìn)一步說(shuō)明了rmlA基因是分枝桿菌生長(zhǎng)必需基因。 6.RmlA缺乏對(duì)突變菌株mc<'2>155 M-2細(xì)胞形態(tài)的影響在溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)中，取mc<'2>155 M-2突變菌株細(xì)胞用掃描電鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示在30℃條件下，該mc

13、<'2>155 M-2 突變菌株均呈短棒狀、輪廓飽滿、表面光滑的形念。與野生型對(duì)照無(wú)明顯差異。但在42℃條件下，營(yíng)救質(zhì)粒Tb rmlA表達(dá)受影響致使RmlA蛋白缺乏時(shí)，第三天菌體表面出現(xiàn)明顯的塌陷和皺褶，第六天甚至出現(xiàn)大量破碎樣物質(zhì)，菌體輪廓亦不清晰，似乎都粘連在一起，部分細(xì)菌發(fā)生裂解。說(shuō)明RmlA蛋白缺乏對(duì)細(xì)胞壁完整性有影響，可導(dǎo)致細(xì)胞裂解。 7．RmlA缺乏對(duì)突變菌株mc<'2>155 M-2 蛋白質(zhì)譜的影響在溫度轉(zhuǎn)換以后，收獲在4

14、2℃生長(zhǎng)5天的mc<'2>155 M-2 細(xì)菌細(xì)胞提取胞漿蛋白，進(jìn)行雙向凝膠電泳，初步發(fā)現(xiàn)mc<'2>155 M-2 的蛋白質(zhì)譜有所變化。與對(duì)照相比，rmlA基因敲除以后蛋白質(zhì)點(diǎn)變少，由于RmlA的缺乏可能導(dǎo)致許多與胞壁代謝有關(guān)蛋白的降低，需要進(jìn)一步確認(rèn)這些點(diǎn)。 結(jié)論： 本研究以恥垢分枝桿菌mc<'2>155菌株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ骄C明rmlA基因與分枝桿菌生長(zhǎng)的相關(guān)性。我們構(gòu)建了攜帶Sm rmlA∶∶Kan<'R>突變基因的

15、條件復(fù)制質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化mc<'2>155，用Southern印記方法篩選出發(fā)生第一次同源重組的mc<'2>155 M-1突變菌株。又構(gòu)建了攜帶Tb rmlA基因的營(yíng)救質(zhì)粒pCG76-Tb rmlA，并轉(zhuǎn)化mc<'2>155 M-1，當(dāng)Tb rmlA基因表達(dá)時(shí)，mc<'2>155 M-1基因組中的Sm rmlA∶∶Kan<'R>突變基因與Sm rmlA基因發(fā)生第二次同源重組，用Southern印記方法篩選出發(fā)生第二次同源重組的mc<'2>15

16、5 M-2突變菌株，即Sm rmIA基因敲除菌株。根據(jù)Sm rmlA基因敲除菌株在30℃和42℃條件下的生長(zhǎng)曲線，以及在缺乏TbRmlA蛋白條件下Sm rmlA基因敲除菌株細(xì)胞形態(tài)的改變和蛋白質(zhì)譜的變化，我們證實(shí)了編碼結(jié)核分枝桿菌 D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶(RmlA)的rmlA基因是分枝桿菌生長(zhǎng)所必需的基因。缺乏RmlA蛋白使細(xì)菌胞壁成分合成受阻，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡。在缺乏RmlA蛋白時(shí)，細(xì)菌蛋白質(zhì)譜也發(fā)生了改變。我們將進(jìn)一步對(duì)這些

17、蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，以發(fā)現(xiàn)更多的藥物作用靶點(diǎn)。 本研究結(jié)果為參與dTDP-鼠李糖合成的 D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的理想靶標(biāo)提供更有力的證據(jù)，以便用D-葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶促反應(yīng)篩選酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物。 未來(lái)研究方向： 1．重復(fù)和優(yōu)化雙向電泳條件，并根據(jù)雙向電泳結(jié)果，對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)差異點(diǎn)用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，然后用質(zhì)譜方法獲得肽質(zhì)譜并與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，以發(fā)現(xiàn)更多的靶點(diǎn)。然后進(jìn)一步采用分子

18、生物學(xué)的方法，克隆這些差異蛋白的基因，鑒定其功能，以期發(fā)現(xiàn)rmlA基因與其它基因之間是否存在相互調(diào)控相互影響的關(guān)系。 2.用高效液相色譜(HPLC)方法分析Sm rmlA基因敲除菌株與野生型mc<'2>155菌株之間細(xì)胞壁聚糖(聚阿拉伯半乳糖)結(jié)構(gòu)的差異；用氣相色譜(GC)分析二者糖組成的差別； 3.通過(guò)RmlA酶活性檢測(cè)方法的建立，篩選和優(yōu)化有該酶抑制活性的先導(dǎo)化合物，以期尋找到新型抗結(jié)核藥物。在此基礎(chǔ)上，用本文構(gòu)建的rmlA