N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達細胞株的構(gòu)建及其對神經(jīng)生長因子受體TrKA作用影響的研究.pdf

1、N-糖鏈在細胞通訊、生長、分化中起重要的作用，文獻報道有證據(jù)表明N-糖鏈在神經(jīng)發(fā)育中也起重要作用。目前糖組學(xué)(Glycomics)是后后基因組的研究重點。糖基轉(zhuǎn)移酶是廣泛存在的一大類酶，參與了聚糖、糖苷和復(fù)合糖類中糖部分的生物合成，具有高度的底物專一性。目前國際上關(guān)于糖基轉(zhuǎn)移酶的研究較為初步，與其他類型的酶類相比，如參與代謝的酶類等，在酶的表達，受哪些因素調(diào)控等方面研究不夠透徹，而且其涉及的生物學(xué)效應(yīng)則更為廣泛，復(fù)雜。糖基轉(zhuǎn)移酶生物功能

2、的完全闡釋將揭示龐大的相關(guān)生物信息。 N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V，GnT-V/Mgat5，EC 2.4.1.155)作為重要的高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶，是糖蛋白N-糖鏈加工酶之一，具有決定N-糖鏈類型及復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu)的重要作用，催化GlcNAc基團轉(zhuǎn)移至N-糖鏈核心α 1，6臂的α-甘露糖的反應(yīng)，形成N-糖鏈的β1，6分支結(jié)構(gòu)，能形成2、3、4天線的N-糖鏈產(chǎn)物，在

3、蛋白質(zhì)翻譯后修飾中起重要作用，而蛋白糖基化則是生物活性蛋白發(fā)揮其生物功能的必要條件之一，其中包括了具有重要功能的生長因子的受體膜蛋白的修飾。N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V是重要的高爾基體糖基轉(zhuǎn)移酶，參與了糖蛋白N-糖鏈的合成，具有對糖蛋白翻譯后糖基化共翻譯修飾的重要功能。而且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)糖基化共翻譯修飾過程能促使蛋白進行正確折疊，同時蛋白質(zhì)糖基化共翻譯修飾也是真核細胞存活必需的。研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V的缺失能引起受體N-

4、糖鏈異常，糖基化異常能影響某些類型的細胞表面的受體功能，導(dǎo)致受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變。因此本文構(gòu)建GnT-V高表達細胞株研究糖蛋白糖鏈變化對受體功能的影響。 神經(jīng)生長因子NGF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長因子，作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能調(diào)節(jié)神經(jīng)的生長、發(fā)育、分化，通過高親和性的受體TrKA調(diào)節(jié)營養(yǎng)神經(jīng)元，不僅在成神經(jīng)細胞瘤中，NGF受體TrkA表達升高與良好的預(yù)后相關(guān)，而且在神經(jīng)退行性病變中，如帕金森和阿爾茨海默氏癥(AD)，NGF也是治療

5、藥物研究的N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶v高表達細胞株的構(gòu)建及其對神經(jīng)生長因子受體TrKA作用影響的研究熱點。NGF通過高親和性的受體引起軸突生長細胞分化，而低親和性受體引起凋亡，微環(huán)境中NGF過低則不能引起軸突生長。PC12細胞是大鼠腎嗜鎘瘤細胞，具有神經(jīng)細胞的特點，是研究NGF神經(jīng)軸突生長良好的細胞模型，文獻報道，在正常狀態(tài)下50-100 ng/mL左右的NGF刺激幾天后能誘導(dǎo)PC12細胞軸突生長。因此選取該細胞作為研究細胞模型，觀察低濃

6、度NGF刺激下(降低4-8倍)GnT-V高表達后對細胞的影響，而此低濃度下，NGF單獨不足以誘導(dǎo)軸突生長。人神經(jīng)生長因子受體(Trk A)含有4個潛在的N一糖鏈糖基化位點，該位點在神經(jīng)營養(yǎng)因子受體Trk家族中高度保守，提示糖基化可能有重要的作用，另外還有9個不太保守的N-糖鏈糖基化位點。研究發(fā)現(xiàn)，成熟的Trk A受體在保守和可變的N-糖鏈糖基化位點均有糖基化。這些位點的糖基化有兩種不同的功能，一是Trk A受體糖基化是阻止配體不依賴的激

7、活所必需的，去糖基化的TrkA受體核心蛋白在沒有配體激活時也是磷酸化的并且顯示組成性激酶活性作用于信號分子Shc和PLC-γ；二是Trk A受體糖基化是受體定位于細胞膜表面所必需的，只有在細胞膜表面的受體能引發(fā)Ras/Raf/MAP激酶通路。用激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)沒有糖基化的活性Trk受體陷入在細胞內(nèi)，不能定位細胞膜，而且沒有糖基化的活性Trk A受體不能激活Ras-MAP、MEK和ErK激酶通路，因此，沒有糖基化的Trk A受體核心蛋

8、白不能誘導(dǎo)PC12細胞神經(jīng)元的分化。而且文獻報道去糖基化的Trk不能應(yīng)答其配體NGF，即衣霉素預(yù)處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達Trk的PC12細胞后，抑制Trk糖基化，改變了Trk蛋白上GM1(ganglioside，神經(jīng)節(jié)苷脂，酸性糖鞘脂)結(jié)合位點，失去了與GM1形成復(fù)合物的能力。而且文獻報道細胞膜N-糖鏈在神經(jīng)胚胎發(fā)育中有重要作用，值得注意的是GnT-V在神經(jīng)元細胞分化時期此酶的表達升高2-3倍，而GnT-V高表達引起的糖基化修飾的TrkA受

9、體核心蛋白對其功能的影響和對PC12細胞神經(jīng)元的分化影響未見報道。 目前N-糖鏈與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系近年來備受關(guān)注，尤其是與GnT-V相關(guān)的β1，6分支結(jié)構(gòu)的研究。研究表明在惡性腫瘤中，N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V活性增高，其催化產(chǎn)物β1，6分支也增加，腫瘤細胞表面β1，6分支存在能促進其入侵基膜，β1，6分支已成為乳腺癌和結(jié)腸癌腫瘤惡化的標(biāo)志。細胞膜N-糖鏈在個體發(fā)育和腫瘤生成中有顯著變化提示N-糖鏈在細胞分化和細胞增殖轉(zhuǎn)移中

10、有重要作用。而GnT-V在神經(jīng)中的生物學(xué)作用還未見報道。在神經(jīng)發(fā)育中，復(fù)合型N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達細胞株的構(gòu)建及其對神經(jīng)生長因子受體TrKA作用影響的研究N-糖鏈尤其是神經(jīng)組織胚胎發(fā)育必須的。raguchi et al．報道指出腫瘤的侵襲與神經(jīng)軸突的應(yīng)答過程相似的概念，提示在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用的糖基轉(zhuǎn)移酶GnT-V很可能在神經(jīng)中也起重要作用。神經(jīng)軸突的生長與腫瘤的遷移有很多相似之處，包括細胞骨架的變化和參與的信號調(diào)節(jié)通路。至今關(guān)

11、于GnT-V在神經(jīng)中的作用尚無文獻報道，我們主要在此方面進行闡釋。 綜上所述，本文選NGF為靶點，研究GnT-V轉(zhuǎn)染PC12細胞后GnT-V高表達對NGF及受體誘導(dǎo)的軸突生長通路的變化。考慮到目前GnT-V在神經(jīng)中的生物學(xué)作用未見報道，因此本文首次在此方面進行初步的探索研究，首先成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達GnT-V的PC12細胞和mock組細胞，進行了糖鏈和蛋白鑒定。研究NGF誘導(dǎo)軸突生長的影響，結(jié)果表明，GnT-V高表達，能修飾神

12、經(jīng)生長因子受體，引起NGF低濃度下神經(jīng)軸突的生長，轉(zhuǎn)染細胞軸突生長明顯增強，提示GnT-V表達增加對神經(jīng)元分化具有調(diào)節(jié)作用。研究了GnT-V對PC12細胞的生物效應(yīng)，這種促進PC12細胞突起生長的作用，是促分化作用。為了闡釋N-糖鏈的變化，將NGF受體TrKA免疫沉淀后，用凝集素PHA-L分析GnT-V酶作用產(chǎn)物β1，6分支結(jié)構(gòu)糖鏈。同時免疫沉淀TrKA受體，測定NGF受體的信號通路的激活，研究了轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達GnT-V的細胞，mock組

13、細胞TrKA受體磷酸化隨時間的變化，TrKA受體用抗TrKA抗體免疫沉淀垂釣分析磷酸化水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達GnT-V的細胞比mock組細胞磷酸化水平明顯升高。GnT-V轉(zhuǎn)染PC12細胞對NGF刺激軸突信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的敏感性增強?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)低濃度的NGF能引起PC12細胞軸突生長的現(xiàn)象，進一步研究GnT-V對TrKa受體作用的機理。 研究發(fā)現(xiàn)GnT-V高表達，免疫沉淀神經(jīng)生長因子細胞膜受體TrKA糖鏈β 1，6分支結(jié)構(gòu)

14、增加，說明此酶GnT-V能直接糖基化修飾神經(jīng)生長因子高親和性的受體TrKA，同時發(fā)現(xiàn)糖基化修飾的高親和性的受體TrKA的磷酸化增強。為進一步解釋其機制，我們研究了不同時間點TrKA受體的內(nèi)吞，NGF-β孵育不同的時間點，測定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達GnT-V的細胞，mock組細胞NGF-β與受體TrKA結(jié)合內(nèi)吞的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達GnT-V的PC12細胞與mock組相比，TrKA受體內(nèi)吞延遲，提示GnT-V高表達引起的N-糖鏈變化，使得NG

15、F受體TrKA內(nèi)吞延遲，進而增強了受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致神經(jīng)軸突的生長。這些結(jié)果表明，GnT-V高N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V高表達細胞株的構(gòu)建及其對神經(jīng)生長因子受體TrKA作用影響的研究表達，修飾神經(jīng)生長因子受體，增強其功能，能引起低濃度NGF刺激下神經(jīng)軸突的生長，GnT-V在神經(jīng)中可能通過修飾糖蛋白受體調(diào)節(jié)NGF誘導(dǎo)的信號通路，可能在與神經(jīng)生長因子受體相關(guān)的神經(jīng)退行性病變中起作用。本文研究發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V糖基化修飾神經(jīng)

16、生長因子受體TrKA，能調(diào)節(jié)TrKA受體的功能，激活TrKA受體介導(dǎo)的軸突生長的信號通路。此論文的研究意義在于首次闡釋了N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V對神經(jīng)生長因子受體的糖基化修飾作用對TrKA受體功能的影響，其研究結(jié)果為研究N-糖鏈在神經(jīng)中的作用提供了深層次的理論依據(jù)，拓展了對N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V在神經(jīng)中作用的認識。發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶V具有促神經(jīng)分化作用，這種對神經(jīng)生長因子受體TrKA的調(diào)節(jié)作用，可能與神經(jīng)生長因子相