延遲性給予骨橋蛋白促進(jìn)缺血缺氧性腦損傷后血管新生和神經(jīng)元再生.pdf

1、分泌性骨橋蛋白(OPN)為大型分泌性糖蛋白，含精氨酸、甘氨酸和天門(mén)冬氨酸(RGD)模序，通過(guò)與細(xì)胞整合素受體結(jié)合，誘導(dǎo)信號(hào)傳遞，在諸多方面產(chǎn)生作用，包括細(xì)胞粘連、分化、存活及修復(fù)等。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，OPN對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。此外，研究顯示，局灶性腦缺血后OPN表達(dá)存在延遲性。我們認(rèn)為延遲性O(shè)PN表達(dá)能對(duì)腦缺血缺氧性損傷具有保護(hù)作用。
　　 新生鼠隨機(jī)分為以下5組：Sham組、HI組、OPN組、OPN+GRGD

2、SP(GRGDSP為OPN抑制劑)組和OPN+Rac1抑制劑組。Sham組乳鼠進(jìn)行假手術(shù)，其他四組均接受頸總動(dòng)脈結(jié)扎后缺氧2 h。OPN、GRGDSP和Rac1的劑量分別為50 ng、2 ng和50μg。缺血缺氧后4～6 d時(shí)，腦室注射重組OPN進(jìn)行治療。分別于注射后7天和14天檢測(cè)腦萎縮、神經(jīng)功能、神經(jīng)元再生和血管新生，以及VEGF和BDNF表達(dá)。
　　 OPN治療14天后，腦右半球與左半球重量比一定程度增加，同時(shí)脾重與體重比

3、顯著降低。懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分在治療后7天和14天較HI組有所增加。平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)分在治療后14天較HI增加。圓筒試驗(yàn)評(píng)分在治療7天和14天后有所降低。T迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)分在治療后14天顯著增加。同時(shí)，OPN治療14天后，一定程度增加腦神經(jīng)元再生和血管再生，伴有腦內(nèi)VEGF和BDNF表達(dá)顯著增加。而在給予OPN抑制劑和Rac1抑制劑后，OPN的神經(jīng)保護(hù)作用減弱。
　　 延遲性給予OPN對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷具有一定保護(hù)作用，其具體機(jī)制可能通過(guò)

4、Rac1誘導(dǎo)VEGF和BDNF表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)再生和血管新生。
　　 腦中風(fēng)是一組以腦部缺血或出血性損傷相關(guān)癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，又稱(chēng)腦卒中或腦血管意外，具有極高的病死率和致殘率。在發(fā)達(dá)國(guó)家，腦中風(fēng)已經(jīng)成為繼腫瘤、心臟疾病之后導(dǎo)致死亡的第三大疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有1500萬(wàn)人發(fā)生腦中風(fēng)，其中500萬(wàn)人因此而死亡，同樣約有500萬(wàn)中風(fēng)患者出現(xiàn)行動(dòng)不便或終身殘疾。在我國(guó)，每年有約150萬(wàn)人死于腦中風(fēng)。美國(guó)因腦中

5、風(fēng)導(dǎo)致的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)300～409億美元，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。
　　 骨橋蛋白(OPN)，又稱(chēng)之為骨涎蛋白I(BSP-1)、早期T淋巴細(xì)胞活化因子1(ETA-1)或分泌型磷蛋白1(SPP1)，該蛋白在人類(lèi)和其他種屬中存在較高的同源性。OPN屬于SIBLING糖蛋白，首先于1986年在成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。OPN基因包括7個(gè)外顯子，跨度5 kb，在人體，定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂。該蛋白由約300個(gè)氨基酸殘基組成，連接有3

6、0個(gè)碳水化合物殘基，其中包括10個(gè)唾液酸殘基。OPN富含酸性殘基，其中30％～60％為天門(mén)冬氨酸殘基或谷氨酸殘基。OPN為糖基化的磷酸蛋白，許多組織和細(xì)胞都能合成，并分泌入體液中。OPN能與包括一些整合素和CD44變異體在內(nèi)的受體結(jié)合，參與了多種生理學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，包括傷口愈合、骨的更新、腫瘤形成、炎癥、缺血和免疫反應(yīng)。Lee等人研究顯示大鼠前腦缺血后存在OPN暫時(shí)性蛋白和mRNA表達(dá)升高。Wang等人的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，OPN在局灶性腦

7、缺血后存在延遲性表達(dá)，峰值出現(xiàn)在損傷后約5天左右。同時(shí)，其他實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，OPN通過(guò)其自身RGD模序與其受體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，如Akt、p42/p44 MAPK信號(hào)通路，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。因此，腦缺血損傷后誘導(dǎo)的OPN表達(dá)增加可能對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)性機(jī)制，可以通過(guò)外源性給予OPN保護(hù)腦損傷，防止損傷進(jìn)一步加重。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究延遲性給予OPN是否對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷產(chǎn)生保護(hù)及其OPN是否能通過(guò)誘導(dǎo)血管新生和/或神經(jīng)

8、元再生發(fā)揮該保護(hù)作用?；谏鲜黾僭O(shè)，我們進(jìn)行了以下工作：
　　 1.新生鼠缺血缺氧性腦損傷后從第4日開(kāi)始，連續(xù)3天腦室注射OPN、OPN+GRGDSP(OPN抑制劑)和OPN+Rac1抑制劑。于治療后第7天和第14天檢測(cè)神經(jīng)功能；
　　 2.每日稱(chēng)量體重，檢測(cè)治療后14天左右腦半球重及脾重；
　　 3.Western Blot檢測(cè)治療后14天損傷側(cè)腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)

9、的表達(dá)；
　　 4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)治療后腦內(nèi)CD34或DCX與BrdU共表達(dá)，以研究治療后的神經(jīng)元再生和血管新生。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.連續(xù)3天腦室OPN注射后7天和14天，神經(jīng)功能一定程度改善；
　　 2.與HI組相比，雖然體重未見(jiàn)顯著變化，但左右腦重比有所改善，且脾重/體重比顯著下降；
　　 3.相對(duì)于治療結(jié)束后14天，腦內(nèi)VEGF和BDNF表達(dá)一定程度增加；