內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生鼠缺氧缺血性腦損傷中的作用.pdf

1、圍產(chǎn)期窒息所致缺氧缺血性(hypoxic-ischemic，HI)腦損傷，是導致新生兒死亡和慢性殘障的主要原因。全球每年用于HI腦病治療和護理的費用給社會、家庭和個人帶來沉重負擔。由于新生兒大腦的不同部位對HI損傷呈選擇性，針對特定易損神經(jīng)系統(tǒng)和細胞群的治療機會非常有限。探索HI腦損傷確切機制并尋找有效治療方案，是目前醫(yī)學領域的重要課題之一。
　　研究表明，谷氨酸作用與N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的神經(jīng)興奮毒性和氧化

2、應激在HI腦損傷中扮演重要角色，我們前期在HI腦損傷動物模型中也證實了這一點。在成年腦缺血模型中，興奮毒性和氧化損傷，可直接或間接激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1），催化合成大量死亡分子聚腺苷二磷酸核糖（Poly ADP-ribose,PAR）聚合物，誘導線粒體凋亡誘導因子(Apoptosis Inducing Factor，AIF)進入細胞核，導致PARP1依賴性細胞死亡（Parthanatos）的發(fā)生。新近發(fā)現(xiàn)的NMDA受體

3、誘導產(chǎn)生的存活蛋白Iduna，是一種內(nèi)源性PAR/AIF死亡通路抑制劑，可通過特異性結合PAR，干擾AIF核轉位，從而抑制谷氨酸及其NMDA受體興奮毒性介導的細胞死亡。上調(diào)Iduna的表達水平，能夠抑制PAR信號介導的Parthanatos，從而對NMDA受體興奮毒性引起的腦損傷產(chǎn)生保護作用。那么Iduna蛋白在新生鼠中的表達與定位是怎樣的情況？新生鼠HI腦損傷過程中是否同樣存在由PAR介導的神經(jīng)元細胞Parthanatos死亡呢？而I

4、duna表達與AIF的關系如何？在原代神經(jīng)元細胞中上調(diào)Iduna后，是否會降低氧糖剝奪(OGD)對細胞造成的損傷呢？本研究主要有三個部分，實驗一擬研究以新生大鼠為對象，觀察Iduna在腦組織中的表達及細胞定位。實驗二擬研究新生大鼠HI腦損傷過程中，大腦皮層損傷與Iduna的關系，以及Iduna表達與AIF的關系。實驗三擬構建大鼠Iduna cDNA的慢病毒表達質(zhì)粒，觀察原代神經(jīng)元細胞中Iduna上調(diào)后細胞損傷情況。
　　第一部分：

5、內(nèi)源性促生存蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達及細胞定位
　　目的：明確內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠腦組織中的表達水平及其細胞定位。
　　方法：取SD新生鼠各器官組織，采用Western-blot評價Iduna蛋白表達的組織特異性。制作SD新生鼠腦組織石蠟與冰凍切片，通過免疫組織化學觀察Iduna蛋白在新生鼠腦組織的表達水平及定位特點，免疫熒光三標腦組織冰凍切片確認Iduna在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中的定位。培養(yǎng)原代

6、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞，Real-time PCR定量分析Iduna在兩種神經(jīng)細胞中的表達水平。在原代神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞中通過免疫熒光雙染NeuN和GFAP驗證Iduna的細胞定位。
　　結果：Western-blot結果提示新生鼠肺組織中Iduna表達水平最高，其次為腦和脊髓組織；腦組織免疫組化染色顯示Iduna主要表達在皮層和海馬區(qū)域；大腦海馬免疫熒光三標提示Iduna主要表達于神經(jīng)元細胞的胞漿內(nèi)（79.85％），原代神經(jīng)細胞

7、的免疫熒光三染也驗證了這一結果（80.6%）；RT-PCR證實Iduna在神經(jīng)元中的表達豐度遠遠高于星形膠質(zhì)細胞（P<0.001）。
　　結論：1、內(nèi)源性存活蛋白Iduna在新生大鼠各器官中的表達具有組織特異性，腦組織是Iduna高表達的臟器。2、腦組織中Iduna主要分布在海馬及皮層區(qū)域。3、海馬區(qū)和皮層區(qū)域Iduna均主要定位于神經(jīng)元胞漿中，提示其可能與神經(jīng)元的功能有關。
　　第二部分:新生鼠缺氧缺血性腦損傷中Iduna

8、和AIF表達的相關性
　　目的：觀察7日齡大鼠缺氧缺血性腦損失后腦皮層中Iduna與AIF表達的變化及相關性。
　　方法：96只新生大鼠被分為假手術組，缺氧1h和缺氧2h三組。在缺氧缺血性腦損傷24h后，通過HE染色、尼氏染色、透射電鏡、TUNEL染色和免疫熒光法來評估HI對新生鼠大腦皮層神經(jīng)元存活數(shù)量的影響。免疫組化分析HI對皮層組織Iduna表達與DNA損傷的影響。用免疫組織化學和蛋白印跡分析來檢測HI對新生大鼠皮層Id

9、una表達水平與核內(nèi)AIF含量的影響。并在HI腦損傷1個月時通過Morris水迷宮評估大鼠遠期的學習和記憶能力。
　　結果：與假手術組比較，HI腦損傷后大腦皮層結構紊亂、神經(jīng)元存活數(shù)量減少、細胞亞細胞器（線粒體）結構破壞以及細胞DNA斷裂加劇。且缺氧2h比缺氧1h大鼠的腦損傷更加嚴重。另外，當Iduna表達明顯減少時細胞核內(nèi)的AIF表達增加。缺氧2h后Iduna表達下降并與核內(nèi)AIF表達呈負相關，有統(tǒng)計學意義(r=-0.950，P

10、<0.0001)。缺氧后的大鼠遠期學習和記憶能力均下降。
　　結論：1、新生鼠缺氧缺血性腦損傷進程中，大腦皮層組織損傷嚴重、神經(jīng)存活數(shù)量減少、神經(jīng)細胞DNA損傷嚴重。2、伴隨缺氧缺血時長的增加，皮層組織中內(nèi)源性存活蛋白Iduna含量顯著下降，同時胞核內(nèi)AIF的含量顯著增多。3、出生早期的缺氧缺血損傷能夠顯著影響大鼠遠期的學習記憶能力。
　　第三部分：細胞水平觀察上調(diào)Iduna對缺氧神經(jīng)元損傷的影響
　　目的：構建大鼠I

11、duna cDNA的慢病毒表達質(zhì)粒(PCDH-Iduna)，包裝Iduna過表達慢病毒，以期上調(diào)原代神經(jīng)元細胞中Iduna的表達。觀察Iduna上調(diào)后對神經(jīng)元細胞氧糖剝奪后細胞活性的影響。
　　方法：提取SD大鼠腦組織總RNA，利用RT-PCR的方法獲取大鼠Iduna cDNA序列，將其插入慢病毒過表達載體PCDH質(zhì)粒中，經(jīng)酶切和測序驗證重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。將PCDH-Iduna（以PCDH-EGFP為陰性對照）及包裝質(zhì)

12、粒共轉染HEK293T細胞，包裝Iduna過表達慢病毒，顯微鏡下觀察HEK293T細胞的形態(tài)變化，了解病毒包裝情況。用慢病毒感染原代神經(jīng)元細胞，Western blot檢測靶細胞中Iduna的表達效率。待Iduna上調(diào)后，進行氧糖剝奪實驗并采用MTT法、LDH和彗星實驗檢測細胞活性。
　　結果：瓊脂糖凝膠電泳顯示Iduna的PCR擴增產(chǎn)物大小為1068bp左右片段，酶切鑒定可見有約1000bp左右片段釋放，且測序結果提示克隆正確。

13、將Iduna過表達慢病毒表達載體PCDH-Iduna及包裝質(zhì)粒共同轉染HEK293T細胞后，鏡下可見細胞呈現(xiàn)出毒時特有的致細胞病變效應。Iduna過表達慢病毒及其對照病毒感染原代神經(jīng)元細胞，免疫熒光及Western-blot檢測提示病毒感染的神經(jīng)元細胞中Iduna表達增加。MTT檢測顯示，氧糖剝奪可導致神經(jīng)元細胞存活率顯著下降(P<0.01)，而Iduna過表達后可顯著抵抗氧糖剝奪引起的神經(jīng)元細胞存活率下降(P<0.5)。LDH漏出率檢

14、測，氧糖剝奪可使神經(jīng)元乳酸脫氫酶漏出率增加(P<0.001)，而Iduna過表達后可減少氧糖剝奪引起的乳酸脫氫酶漏出(P<0.5)。彗星實驗得出上調(diào)Iduna可以減少OGD對神經(jīng)元DNA完整性的損傷。
　　結論：1、成功構建了慢病毒過表達重組質(zhì)粒PCDH-Iduna。2、包裝獲得了具有良好感染效率的Iduna過表達慢病毒，顯著上調(diào)了原代神經(jīng)元細胞中Iduna的表達水平。3、上調(diào)Iduna的表達可顯著抑制OGD引起的神經(jīng)元損傷（如改