皮層神經(jīng)元缺氧損傷與鈉泵功能相關(guān)性研究.pdf

1、腦缺氧導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞變性，因而腦功能喪失。當(dāng)前普遍認(rèn)為，缺氧損傷中谷氨酸大量釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過量的Ca<'2+>蓄積，從而引起神經(jīng)元死亡。 鈉泵又稱Na<'+>，K<'+>-ATP酶，是一種膜結(jié)合蛋白，可通過水解一分子ATP將三個Na<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外同時攝取兩個K<'+>進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生電化學(xué)梯度，維持細(xì)胞滲透壓平衡和靜息電位，因此鈉泵是維持Na<'+>動態(tài)平衡、體液和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。 當(dāng)哺乳動物腦組織的氧或血流供應(yīng)

2、低于臨界值時就會出現(xiàn)能量障礙，僅僅缺氧5 min ATP下降90％，而丟失50～60％的ATP時鈉泵活性下降，細(xì)胞膜去極化進(jìn)而鈉和水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。去極化使電壓門控性鈣通道開放Ca<'2+>內(nèi)流，同時崩塌的Na<'+>梯度引起Na<'+>依賴性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體排除谷氨酸到細(xì)胞間隙，激活谷氨酸受體導(dǎo)致大量Ca<'2+>內(nèi)流，繼而出現(xiàn)Ca<'2+>依賴性細(xì)胞損傷。 由此可見，鈉泵在腦缺血的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。但目前對其研究大多數(shù)

3、集中在心肌細(xì)胞、腎臟、骨骼肌、血管平滑肌，而對腦組織鈉泵的分布及功能特性研究較少，特別是其在腦缺血、缺氧狀態(tài)下，功能和特性的改變及其可能機(jī)制的研究甚少，本研究旨在選取對缺血較敏感的皮層神經(jīng)元(Ⅴ和Ⅵ層錐體細(xì)胞)，研究鈉泵電生理特性及其在缺氧中的改變，并探討其可能機(jī)制。 一、腦片皮層神經(jīng)元鈉泵的電生理特性 目的：應(yīng)用腦片皮層神經(jīng)元研究鈉泵電流的特性。 方法：選取出生11～14天SD大鼠，深度麻醉后斷頭，快速取出腦組

4、織放入冰冷的人工腦脊液(ACSF)中，取前腦切成300 μm的溥片，儲存在95％O<,2>+5％CO<,2>飽和的ACSF中。然后將制備好的皮層腦片放置于灌流槽中，持續(xù)灌流95％O<,2>和5％CO<,2>飽和的ASCF，流速為1～2ml/min，使腦片浸沒于液面下。在紅外微分干涉相差顯微鏡下，移動電極至細(xì)胞上方負(fù)壓吸引形成封接，再以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，并將細(xì)胞鉗制在-60mV，當(dāng)膜電流穩(wěn)定時，先通過膜去極化程序(

5、-60mV-0mV--60mV)激活Na<'+>電流來鑒別正在記錄的細(xì)胞是神經(jīng)元，然后換為含不同濃度哇巴因(Oua，10<'-12>～10<'-3>mol/L)的ACSF，以全細(xì)胞膜片鉗方式記錄皮層神經(jīng)元鈉泵電流，并以10<'-3>mol/L Oua產(chǎn)生的泵電流幅度為100％，計(jì)算各濃度Oua產(chǎn)生的泵電流(Ip)的變化率(△Ip)，并以此為縱坐標(biāo)，以O(shè)ua濃度([Oua])為橫坐標(biāo)，繪制△Ip-[Oua]關(guān)系曲線。整個實(shí)驗(yàn)在室溫(23±

6、2℃)下進(jìn)行結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)膜電壓鉗制在-60mV時，低濃度Oua灌流可引起膜電流的外向移動，但較高濃度的Oua灌流，則可劑量依賴性引起膜電流的內(nèi)向移動，其中1 mmol/L Oua引起的膜電流內(nèi)向移動幅度與切換無K細(xì)胞外液所致的膜電流內(nèi)向移動幅度相同，證明該Oua敏感性電流為鈉泵電流。 本研究采用10<'-12>～10<'-3>mol/L的Oua分別在96個神經(jīng)元測定了泵電流，根據(jù)神經(jīng)元鈉泵對10<,-8>mol/L O

7、ua的反應(yīng)，可將鈉泵電流對Oua(10<'-12>～10<'-3>mol/L)的△Ip-[Oua]關(guān)系曲線分為興奮、抑制和無作用三種模式。 結(jié)論：皮層的錐體神經(jīng)元表達(dá)兩種功能不同的鈉泵，即高親和力鈉泵和低親和力鈉泵。鈉泵電流不僅具有Oua敏感性還具有電壓依賴性。 二、缺氧對皮層神經(jīng)元鈉泵的影響 目的：研究缺氧對皮層神經(jīng)元鈉泵活性和α亞基表達(dá)的影響。 方法：通過缺氧培養(yǎng)皮層神經(jīng)元以及用N<,2>飽和的無糖A

8、CSF灌流皮層腦片，建立皮層神經(jīng)元的氧糖分離缺氧模型。通過檢測缺氧0、2、4、8和12小時后培養(yǎng)皮層神經(jīng)元培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量，評價(jià)缺氧對培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的損傷程度；應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測缺氧0、0.5、1、2、4和8小時后培養(yǎng)皮層神經(jīng)元內(nèi)Ca<'2+>濃度([Ca<'2+>]<,i>)(fluo-3的熒光強(qiáng)度)的變化；采用TTC染色評價(jià)缺氧0、5、10、15、30、45和60rnin對皮層腦片神經(jīng)元活性的影響。 通

9、過無機(jī)磷分光光度計(jì)法，檢測缺氧培養(yǎng)皮層神經(jīng)元在缺氧0、2、4和8小時鈉泵活性的改變；通過雙酶法，檢測皮層腦片缺氧0、15、30和60min時鈉泵活性的改變。采用腦片膜片鉗裝置觀察缺氧0、2、4、6、8、10、15和20min對腦片皮層神經(jīng)元鈉泵電流的改變。 采用RT-PCR和Westerrlblot方法，觀察缺氧0、4、8和12小時對培養(yǎng)皮層神經(jīng)元α 1和α 3亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以及缺氧0、5、10、1 5、30和6

10、0min對皮層腦片α 1和α3亞基mRNA和蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)論：采用缺氧孵育腦片和缺氧培養(yǎng)神經(jīng)元模型可成功模擬兩種不同的缺氧性腦損傷。在缺氧早期階段皮層神經(jīng)元鈉泵活性代償性升高，但隨缺氧時間的逐漸延長活性降低。缺氧培養(yǎng)調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元mRNA和蛋白水平的表達(dá)，α 1亞基表達(dá)升高，α3亞基表達(dá)降低 三、低親和力鈉泵參與了皮層神經(jīng)元缺氧損傷 目的：比較皮層神經(jīng)元高親和力鈉泵和低親和力鈉泵在缺氧損傷中的作用。

11、 方法：通過灌流不同時間無糖低氧ACSF，制備培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和皮層腦片的氧糖分離模型。缺氧0、2、4、6、8或10min觀察皮層腦片神經(jīng)元膜電流的改變(△I/Cm)，或者給予TTX(1 μmol/L)后同時缺氧，或者缺氧6min時給予TTX繼續(xù)缺氧觀測膜電流的改變。 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經(jīng)元膜電流變化的影響：采用Oua 10nmol/L興奮高親和力鈉泵、Oua 100 nmol/L抑制高親和力鈉泵或者Oua10μmol/L

12、部分抑制低親和力鈉泵后，檢測缺氧0、2、4、6、8和10min 時△I/Cm。＃＃ 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>和[Na<'+>]<,i>變化的影響：采用可視化動緣探測系統(tǒng)檢測培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>和[Na<'+>]<,i>熒光信號(Fura-2 10 μmol/L和SBFI 10 μmol/L)，①無氧無糖的HBS灌流培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元10 min，分別于缺氧0、2、4、6、8和1 0 mi

13、n時測定神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>熒光比值(ARatio)，比較不同時間點(diǎn)△Ratio。②連續(xù)灌流含Oua(10<'-9>～10<'-3> mol/L)的正常HBS 2 min，測定[Na<'+>]<,i> △Ratio。③以O(shè)ua 100nmol/L、10 μmol/L或1 mmol/L的正常HBS預(yù)先處理皮層神經(jīng)元，然后換為含有同樣濃度Oua的無氧無糖HBS，連續(xù)記錄10 min，測量0、2、4、6、8和10 min時神經(jīng)元[

14、Ca<'2+>]<,i> ARatio。 結(jié)果：缺氧增大神經(jīng)元膜電流：無糖低氧ACSF灌流10 min，神經(jīng)元膜電流則逐漸增大(P<0.0 1)，在缺氧0、2、4、6、8和10 min時，其增加的膜電流密度分別為0、-0.014±0.006、-0.028±0.013、-0.035±0.016、-0.044±0.022、-0.058±0.026和-0.074±0.025 pA/pF，呈時間依賴性升高(r=0.98028，P<0.0

15、1)，說明缺氧可引起皮層神經(jīng)元膜上離子通道的異常開放。 缺氧增大的膜電流為TTX敏感性Na通道電流：在阻斷K<'+>和Ca<'2+>通道的液體環(huán)境中，所記錄到的膜電流主要為鈉電流，缺氧引起的腦片皮層神經(jīng)元膜電流增加可以被TTX(1μmol/L)阻斷。若先使神經(jīng)元急性缺氧6 min后再給予TTX，則TTX可抑制缺氧增加的膜電流繼續(xù)增大，僅使其維持在缺氧6 min時的電流水平而不能恢復(fù)至正常，在10 min時，膜電流的改變值為-0.

16、033±0.013 pA/pF，與缺氧10 min時-0.058±0.028 pA/pF相比較有顯著差異(P<0.01)。提示缺氧引起的膜電流增加可能與去極化所致的鈉通道開放有關(guān)。 結(jié)論：缺氧使Na+進(jìn)入皮層神經(jīng)元以及[Ca<'2+>]<,i>升高，同時阻斷鈉泵功能可通過升高皮層神經(jīng)元[Na<'+>]<,i>水平影響[Ca<'2+>]<,i>，以及完全抑制鈉泵功能，可在4 min以內(nèi)阻斷缺氧介導(dǎo)的皮層神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,