缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)再生及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是造成新生兒死亡，形成腦性癱瘓、先天性認(rèn)知障礙、生長(zhǎng)遲緩、智力低下及癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥主要原因，但現(xiàn)在仍然沒有有效的措施能夠改善因圍產(chǎn)期窒息所致的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。我們通過建立新生鼠缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型，探討基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)及Nogo受體拮抗劑(NEP1-40)與缺氧缺血性腦損傷的相關(guān)研究。
　　第一部分\SDF-1對(duì)新

2、生小鼠缺氧缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:SDF-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血和缺氧等損傷后，發(fā)揮清除壞死組織和促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。本研究旨在探討SDF-1對(duì)新生小鼠HIBD后表達(dá)變化規(guī)律及其與HIBD后細(xì)胞凋亡及增殖的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:將7日齡新生小鼠，隨機(jī)分為空白組、缺氧缺血性腦損傷(HIBD)組、SDF-1干預(yù)組，每組40只。HIBD組及SDF-1干預(yù)組小鼠制備缺氧缺血性腦損傷模型。造模成功后30min立即給予腹

3、腔注射SDF-12.0μg/d，間隔24小時(shí)后再次給予，連用7d;空白組與HIBD組腹腔注射生理鹽水。在腦缺氧缺血后24h、3d、7d、14d處死小鼠。采用(1) HE染色檢測(cè)腦組織病理損傷程度;(2)RT-PCR技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬組織SDF-1 mRNA及蛋白表達(dá);(3)Western Blotting及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)凋亡蛋白酶caspase-3;(4)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Ki67表達(dá);(5)并于造模后14d通過跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)及高架十

4、字迷宮實(shí)驗(yàn)觀察小鼠缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色結(jié)果空白組小鼠腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常;HIBD組小鼠腦組織在HIBD后神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，空泡化，壞死，核固縮和核碎裂;SDF-1治療減輕腦組織病理損傷程度。
　　2.免疫熒光方法觀察SDF-1蛋白的表達(dá)低倍鏡下小鼠分別于紋狀體，海馬，齒狀回，胼胝體及白質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)綠色的SDF-1表達(dá)陽性細(xì)胞。正常小鼠SDF-1陽性細(xì)胞

5、分布較稀疏。HIBD組缺氧缺血后，SDF-1陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。在造模后24時(shí)，SDF-1陽性細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯的增多，出現(xiàn)在缺血側(cè)紋狀體及海馬;于3d時(shí)達(dá)到高峰，主要在缺血側(cè)紋狀體，海馬及齒狀回區(qū)域，7d時(shí)有所回落，僅見外囊，胼胝體及白質(zhì)區(qū)少量表達(dá)。SDF-1干預(yù)組免疫陽性細(xì)胞表達(dá)區(qū)域與HIBD組相同，24h，3d，7d時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR檢測(cè)SDF-1mRNA的

6、表達(dá)水平各組在不同時(shí)間點(diǎn)大腦結(jié)扎側(cè)海馬均有SDF-1 mRNA及表達(dá)?？瞻捉M各時(shí)間點(diǎn)可見少量SDF-1mRNA表達(dá)，HIBD組，24h，3d，7d海馬組織SDF-1mRNA表達(dá)均較空白組有明顯增加(P＜0.05)，3d時(shí)增加最為顯著，之后表達(dá)回落。SDF-1干預(yù)組SDF-1mRNA較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)，7d時(shí)表達(dá)降低不顯著，與HIBD組比較差異顯著(P＜0.05)。
　　4.免疫熒光及Western Blotting檢測(cè)各組海馬組織C

7、aspase-3蛋白表達(dá)的結(jié)果Caspase-3免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn):空白組小鼠僅見散在分布的綠色的caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞。在缺氧缺血后24小時(shí)，caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少;SDF-1干預(yù)組能明顯減少caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量，與HIBD組相應(yīng)時(shí)間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　Caspase-3蛋白Western Blotting結(jié)果與免疫熒光染色看到相同

8、的結(jié)果。
　　5.免疫熒光檢測(cè)Ki67陽性細(xì)胞正常小鼠腦室管膜下區(qū)僅見少量Ki67陽性細(xì)胞，分布較稀疏。HIBD組缺氧缺血后3d，Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，于7d時(shí)達(dá)到高峰，14d陽性細(xì)胞數(shù)量減少，與7d時(shí)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。SDF-1組在缺氧缺血后Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量也出現(xiàn)明顯的增多，7d達(dá)高峰后略下降，14d時(shí)Ki67陽性細(xì)胞數(shù)較7d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　6.免疫熒光檢測(cè)TGF

9、β1表達(dá)水平空白組各時(shí)間點(diǎn)幾乎沒有TGFβ1的表達(dá);HIBD組24h表達(dá)很弱，后逐漸升高，3d時(shí)達(dá)到高峰，7d時(shí)消失。SDF-1組在HIBD后24h即達(dá)到高峰，3d時(shí)仍持續(xù)高表達(dá)，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)HIBD組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與同組24h相比，差異不顯著（P＞0.05）。
　　7.神經(jīng)行為學(xué)結(jié)果在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，以足錯(cuò)誤次數(shù)判斷學(xué)習(xí)能力，錯(cuò)誤次數(shù)越少，表示學(xué)習(xí)能力強(qiáng);24h后對(duì)動(dòng)物記憶再現(xiàn)，以潛伏期判斷學(xué)習(xí)能力，潛伏期長(zhǎng)，

10、表示記憶能力好。HIBD組小鼠足錯(cuò)誤次數(shù)多，24h后對(duì)動(dòng)物記憶再現(xiàn)的觀察結(jié)果也表明，HIBD組小鼠潛伏期縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，記憶成績(jī)下降，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。SDF-1干預(yù)組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)減少，潛伏期延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)成績(jī)及記憶能力都較HIBD組提高。
　　在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，HIBD組與空白組小鼠相比較，探究行為少，進(jìn)入開臂的次數(shù)及時(shí)間百分比均減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。SDF-1干預(yù)組小鼠探

11、究行為增多，進(jìn)入開臂的次數(shù)及時(shí)間百分比均較HIBD組提高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.SDF-1在新生小鼠缺氧缺血性腦損傷后的腦組織中表達(dá)明顯增加，先呈遞增趨勢(shì)，后逐漸下降。
　　2.外源性給予SDF-1能夠減輕HIBD后腦組織病理損傷程度。
　　3.SDF-1能夠抑制凋亡蛋白酶caspase-3的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　4.SDF-1能夠促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷后內(nèi)源性神

12、經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞增殖。
　　5.SDF-1能夠促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷后學(xué)習(xí)記憶能力等神經(jīng)功能改善。
　　第二部分、Nogo-A及Nogo受體拮抗劑與新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后中樞神經(jīng)再生的相關(guān)性研究
　　目的:中樞神經(jīng)損傷后有限的再生能力是新生兒缺氧缺血性腦損傷(HypoxicIschemic Brain Damage，HIBD)的主要原因，Nogo-A是重要的神經(jīng)神經(jīng)再生抑制因子。本研究旨在探討Nogo-A在新生大鼠缺氧缺

13、血性腦損傷后的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，及Nogo受體拮抗劑對(duì)HIBD后促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。
　　方法:將7日齡新生大鼠，隨機(jī)分為空白組、缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型組、NEP1-40干預(yù)組及神經(jīng)節(jié)甘酯(GM-1)干預(yù)組，每組8只。HIBD組、NEP1-40組及GM-1組大鼠制備缺氧缺血性腦損傷模型。造模成功后立即給予NEP1-4012.5μg/d，GM-110mg/(kg.d)腹腔注射，間隔24小時(shí)后再次給予，連用3天或7天;空白組與H

14、IBD組腹腔注射生理鹽水。在腦缺氧缺血后6h、24h、72h、7d處死大鼠。采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)Nogo-A mRNA及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)Nogo-A陽性細(xì)胞表達(dá);透射電鏡觀察腦神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果:
　　1.腦組織中Nogo-A-mRNA陽性細(xì)胞的表達(dá)原位雜交腦組織片中Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞特點(diǎn)為細(xì)胞核棕黃色顆粒，在海馬、皮質(zhì)等部位呈聚集狀態(tài)?？瞻捉MNogo-A mRNA呈基礎(chǔ)性表達(dá)，散在分布于腦組織

15、神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中。HIBD組Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞在造模早期6h即明顯上升，24h、72h及7d神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)大量顯色強(qiáng)陽性棕黃色顆粒，呈明顯的遞增趨勢(shì)，與同時(shí)段空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NEP1-40治療組能抑制HIBD后腦組織Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞表達(dá)與同時(shí)段HIBD組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GM-1組腦組織切片Nogo-A mRNA陽性細(xì)胞在早期亦升高，至24h時(shí)達(dá)高峰，然后

16、開始下降;與同時(shí)段HIBD組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　2.免疫組化染色空白組Nogo-A蛋白陽性細(xì)胞呈棕黃色顆粒，呈基礎(chǔ)性表達(dá)，散在分布于神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和突起中。HIBD后Nogo-A蛋白在大腦皮層、海馬及膠質(zhì)細(xì)胞中強(qiáng)陽性表達(dá)，并且具有一個(gè)動(dòng)態(tài)演變規(guī)律，6h、24h、72h及7d呈明顯的遞增趨勢(shì)。NEP1-40組Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，顯色呈弱陽性，與對(duì)應(yīng)時(shí)期HIBD組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜

17、0.05）。GM-1治療組6h時(shí)Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與HIBD組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），與NEP1-40組相比數(shù)量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); GM-1組腦組織切片Nogo-A的陽性細(xì)胞數(shù)上升至高峰，而24h時(shí)段NEP1-40組陽性細(xì)胞表達(dá)降低，但兩組比較有顯著意義(P＜0.05);72h、7d雖然GM-1組已呈下降趨勢(shì)，但較NEP1-40組仍有差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有意義(P＜0.05）。GM-1抑制HIB

18、D后Nogo-A表達(dá)的發(fā)生較遲后。
　　3.透射電鏡觀察腦神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)HIBD組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，空泡化，多量凋亡小體，神經(jīng)細(xì)胞軸突溶解，破裂。NEP1-40組6h時(shí)與同時(shí)段HIBD組改變不明顯;24h時(shí)腦組織開始出現(xiàn)修復(fù)，神經(jīng)元胞體大小逐步趨于正常，出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)細(xì)胞軸突再生明顯，軸突增多，增粗，增長(zhǎng)，少見凋亡細(xì)胞，7天時(shí)腦組織已有明顯修復(fù)。GM-1組6h時(shí)與同時(shí)段HIBD組改變不明顯;24h時(shí)神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，胞體腫脹

19、明顯，核形規(guī)則，核質(zhì)溶解，可見較多凋亡小體，無軸突再生;72h及7天時(shí)也發(fā)生組織修復(fù)，神經(jīng)元腫脹漸消失，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生，但軸突再生不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦組織中Nogo-A mRNA及Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，6h、24h、72h及7d呈明顯的遞增趨勢(shì)，與抑制神經(jīng)元軸突再生有關(guān)系。
　　2.NEP1-40能同時(shí)特異性抑制Nogo-A等神經(jīng)抑制蛋白與NgR的結(jié)合，拮抗NgR介導(dǎo)