骨髓基質細胞及其上清液側腦室移植對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷海馬神經元的作用.pdf

1、目的：探討缺氧缺血對新生大鼠海馬神經元與學習記憶的影響，及骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）及其上清液移植后對其的治療作用。方法：取7日齡健康SD新生大鼠90只，其中10只取股骨骨髓，體外分離純化培養(yǎng)BMSCs，收集上清液，培養(yǎng)3代后用BrdU標記BMSCs。剩余80只新生鼠隨機分為假手術組、模型組、細胞組和上清液組各20只。模型組新生鼠在無菌環(huán)境下結扎左側頸總動脈，術后護理2小時后置于三氣培

2、養(yǎng)箱持續(xù)缺氧2h（氧濃度為8％，艙內溫度（36±2）℃，濕度（70±5）％），制作新生鼠缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型，繼續(xù)母鼠喂養(yǎng)1w后（14日齡），新生鼠經低溫麻醉，固定于腦立體定位儀下，酒精消毒后切開皮膚暴露顱骨，3％H2O2祛除骨膜，明確解剖位置，在腦立體定位系統(tǒng)的指示下選取左側腦室（坐標AP：-0.5mm，ML：-2mm，DV：-2mm）為移植點，用微量進樣器緩慢注

3、入2μl無菌0.01M的PBS液，術后縫合皮膚、消毒、25℃室溫下復蘇，母鼠喂養(yǎng)。細胞組用體外無菌培養(yǎng)的經BrdU標記的BMSCs（濃度為105/μl）代替0.01M的PBS液，其余同模型組。上清液組用經冰凍干燥濃縮后的BMSCs上清液代替0.01M的PBS液，其余同模型組。假手術組僅暴露左側頸總動脈，但不結扎，并且不放入三氣培養(yǎng)箱缺氧，其余同模型組。各組大鼠在側腦室注射術后8周，進行為期11 d的Morris水迷宮測試，記錄探查訓練時

4、大鼠在目標象限的搜索時間（T1）和對位探查訓練時大鼠在目標象限的搜索時間（T2）。水迷宮測試結束當日，大鼠經40g/L多聚甲醛灌注固定、取腦、石蠟包埋，經海馬平面作冠狀切片（片厚5μm）。各例大鼠大腦切片分別做神經元的特異性標記--特異烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、神經膠質細胞的標記--膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和突觸素（Synapt

5、ophysin，SY）免疫組化染色，細胞組大鼠大腦切片并做BrdU免疫組化染色。各切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70顯微成像系統(tǒng)對海馬拍照。IPP6.0軟件圖像分析。統(tǒng)計學分析：組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。結果：Morris水迷宮實驗顯示模型組大鼠T1和T2分別均較假手術組大鼠縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；細胞組和上清液組大鼠T1和T2分別均較模型組大鼠延長（P<0.05），但細胞組和上清液組大鼠T1和

6、T2比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。NSE和SY免疫組化結果顯示模型組大鼠海馬陽性細胞積分光密度（integral optical density，IOD）值均較假手術組IOD值減?。≒<0.05），細胞組和上清液組IOD值分別均較模型組增加（P<0.05），但細胞組和上清液組該兩指標的IOD值之間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。GFAP免疫組化結果顯示模型組大鼠海馬陽性細胞IOD值較假手術組IOD值增加（P<0.05），

7、細胞組和上清液組IOD值均較模型組增加（P<0.05），但細胞組和上清液組IOD值之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。細胞組BrdU免疫組化結果未見陽性細胞。結論：1.結扎一側頸總動脈，并經一定時間（2h）、一定氧濃度（氧濃度8％）的缺氧可致新生大鼠海馬神經元的損傷，并導致大鼠學習記憶降低，其機制與缺氧缺血對海馬神經元的直接損傷有關。2.2μL BMSCs及上清液濃縮物側腦室注射可減輕缺氧缺血后神經元的損傷，并可改善大鼠的學習記憶