利福平保護MPTP所致小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(PD)又名震顫麻痹，是一種中老年人常見的慢性黑質(zhì)和黑質(zhì)紋狀體通路變性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部(SNc)多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性地變性、死亡、缺失，以及殘存神經(jīng)元細胞DA生物合成能力下降，致紋狀體DA不足，從而導致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂。在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)等四大主要特征。國外的統(tǒng)計資料表明，PD發(fā)病率占總?cè)藬?shù)的0.1％-0.2％，其中55歲以上人口占1

2、.4％。隨著社會逐步進入老齡化，PD患者的人數(shù)也在日趨增加。 目前PD的病因尚未清楚，一般認為是由遺傳、年齡、環(huán)境、氧化應激、免疫異常、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙等多種因素所致的中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元死亡，而細胞凋亡是這種細胞死亡的主要方式。對神經(jīng)元的保護和抗細胞凋亡的治療已成為PD治療的主要思路。目前PD細胞凋亡的常用治療方案有：1.抗氧化劑。2.神經(jīng)營養(yǎng)因子。3.中藥。4.基因治療。5.對凋亡過程的調(diào)控，如凋亡起始因子的

3、抑制劑、抗凋亡基因的促進劑等。神經(jīng)保護劑的抗凋亡治療已在臨床上開始使用，并取得了一些療效，但仍存在異議。 由于PD病人死后腦標本難以獲得，因此建立動物模型是研究該病發(fā)病機制和治療方法的重要手段。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)是一種神經(jīng)毒素，在體內(nèi)經(jīng)B型單胺氧化酶(MAO-B)催化轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆?苯基-吡啶離子(MPP+)，后者能選擇性損害黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，造成DA能神經(jīng)元三磷酸腺苷耗竭，并且通過促進活性氧和

4、過量一氧化氮的生成而發(fā)揮毒性作用，對DA能神經(jīng)元造成選擇性的損傷而出現(xiàn)壞死和凋亡。用MPTP制備的鼠模型是國內(nèi)外公認的PD動物模型之一，已被廣泛用于該病發(fā)病機制和治療等研究。常用的PD模型小鼠為C57BL小鼠。 MPTP可導致C57BL小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡，但其具體機制尚不十分明確。本實驗以MPTP腹腔注射建立C57BL小鼠PD模型，通過免疫組織化學方法對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進行檢測，探討MPTP的作用機制。近期研究發(fā)現(xiàn)利福平(RFP

5、)具有抗凋亡和神經(jīng)保護作用，但是否對動物體內(nèi)的DA能神經(jīng)元經(jīng)MPTP處理后的細胞凋亡有抑制作用尚未見報道，而國內(nèi)關于RFP與細胞凋亡、神經(jīng)保護關系亦未見相關報道。本研究利用常用的MPTP致C57BL小鼠PD模型，探討RFP在PD中的神經(jīng)保護作用。 第一章帕金森病MPTP小鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化的實驗研究 研究目的 建立MPTP致C57BL小鼠PD模型，通過行為學觀察和免疫組織化學方法對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進行檢

6、測，探討MPTP的作用機制。 方法 取C57BL雄性小鼠16只，采用完全隨機方法隨機分為模型組(n=8)和對照組(n=8)。模型組腹腔注射30mg/kg體重的MPTP，每天1次，連續(xù)5天。對照組腹腔注射等容量生理鹽水(NS)，每天1次，連續(xù)5天。通過行為學觀察、黑質(zhì)Nissl染色及免疫組織化學染色，觀察MPTP對小鼠的行為學表現(xiàn)及SNcNissl、酪氨酸羥化酶(TH)、Bcl-2、Caspase-3陽性細胞的影響。

7、 結(jié)果 小鼠注射MPTP后出現(xiàn)肢體震顫、弓背、豎尾、豎毛、后肢張開、運動遲緩、步態(tài)不穩(wěn)等改變、肢體僵硬、活動明顯減少，精神差，個別出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作。隨著給藥次數(shù)的增加，其運動減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應遲緩的表現(xiàn)越來越明顯。同時，SNc的Nissl、TH陽性細胞顯著減少(P=0.000)，Bcl-2和Caspase-3陽性細胞數(shù)顯著增多(P=0.000)，尤以Caspase-3陽性細胞為著，為對照組的四倍多。 結(jié)論

8、 MPTP誘發(fā)的C57BL小鼠PD模型成功率高，死亡率低，能較好地模擬PD的行為學、病理學等方面的改變，是一種較為理想的PD動物模型。本組有些行為反應(運動減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應遲緩等)較文獻報道為重，考慮與給藥途徑、劑量、時間，對行為學改變進行觀測的時間及C57BL小鼠亞型、性別、鼠齡等有關。MPTP誘發(fā)的C57BL小鼠PD模型中細胞凋亡可能是MPTP的主要毒性作用方式，其通過Caspase-3途徑產(chǎn)生凋亡效應，并引起B(yǎng)c

9、l-2蛋白反應性增高。 第二章利福平保護MPTP所致小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡的實驗研究 研究目的 建立MPTP致C57BL小鼠PD模型，在造模前或后給予RFP，通過行為學觀察和免疫組織化學方法對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進行檢測，觀察RFP對MPTP致PDC57BL小鼠模型的神經(jīng)保護作用。 方法 取C57BL雄性小鼠40只，采用完全隨機方法將動物隨機分為空白組、MPTP組、MPTP+NS組、RFP預處理組

10、(RFP+MPTP組)、MPTP后RFP治療組(MPTP+RFP組)，共計5組，每組8只。MPTP用量：30mg/kg；RFP用量：5mg/kg。采用腹腔注射方法給藥?？瞻捉M不予特殊處置；MPTP組予MPTP1次/d，連用5d；MPTP+NS組給予MPTP2h后予等量NS腹腔注射1次/d，連用5d；RFP預處理組于第1-3d給予RFP1次/d，連用3d，第4-8d給予RFP2h后給予MPTP1次/d，連用5d；MPTP+RFP組在給予M

11、PTP2h后予RFP1次/d，連用5d。通過行為學觀察、黑質(zhì)Nissl染色、免疫組織化學染色，觀察RFP對PD小鼠模型的行為學表現(xiàn)及SNcNissl、TH、Bcl-2、Caspase-3陽性細胞的影響。 結(jié)果 小鼠注射MPTP后出現(xiàn)震顫、豎尾、豎毛、運動遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、肢體僵硬，活動明顯減少。同時，SNc的Nissl、TH陽性細胞顯著減少(P=0.000)，Bcl-2陽性細胞有所增多(P=0.000)，Caspase-3

12、陽性細胞顯著增多(P=0.000)；應用RFP后較MPTP組癥狀減輕，Nissl、TH、Bcl-2陽性細胞增多(P＜0.01)，而Caspase-3陽性細胞減少(P=0.000)；RFP預處理組作用最為顯著(P=0.000)。 結(jié)論 應用RFP后可明顯減輕MPTP導致的PD模型癥狀，顯著降低MPTP引起的Nissl、TH陽性細胞減少及Caspase-3陽性細胞增多，并導致Bcl-2陽性細胞顯著增多。預先應用RFP作用更顯