利福平保護(hù)MPTP所致小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(PD)又名震顫麻痹，是一種中老年人常見的慢性黑質(zhì)和黑質(zhì)紋狀體通路變性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部(SNc)多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性地變性、死亡、缺失，以及殘存神經(jīng)元細(xì)胞DA生物合成能力下降，致紋狀體DA不足，從而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂。在臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等四大主要特征。國(guó)外的統(tǒng)計(jì)資料表明，PD發(fā)病率占總?cè)藬?shù)的0.1％-0.2％，其中55歲以上人口占1

2、.4％。隨著社會(huì)逐步進(jìn)入老齡化，PD患者的人數(shù)也在日趨增加。 目前PD的病因尚未清楚，一般認(rèn)為是由遺傳、年齡、環(huán)境、氧化應(yīng)激、免疫異常、興奮性氨基酸毒性、線粒體功能障礙等多種因素所致的中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元死亡，而細(xì)胞凋亡是這種細(xì)胞死亡的主要方式。對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡的治療已成為PD治療的主要思路。目前PD細(xì)胞凋亡的常用治療方案有：1.抗氧化劑。2.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。3.中藥。4.基因治療。5.對(duì)凋亡過程的調(diào)控，如凋亡起始因子的

3、抑制劑、抗凋亡基因的促進(jìn)劑等。神經(jīng)保護(hù)劑的抗凋亡治療已在臨床上開始使用，并取得了一些療效，但仍存在異議。 由于PD病人死后腦標(biāo)本難以獲得，因此建立動(dòng)物模型是研究該病發(fā)病機(jī)制和治療方法的重要手段。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)是一種神經(jīng)毒素，在體內(nèi)經(jīng)B型單胺氧化酶(MAO-B)催化轉(zhuǎn)變?yōu)榧谆?苯基-吡啶離子(MPP+)，后者能選擇性損害黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，造成DA能神經(jīng)元三磷酸腺苷耗竭，并且通過促進(jìn)活性氧和

4、過量一氧化氮的生成而發(fā)揮毒性作用，對(duì)DA能神經(jīng)元造成選擇性的損傷而出現(xiàn)壞死和凋亡。用MPTP制備的鼠模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的PD動(dòng)物模型之一，已被廣泛用于該病發(fā)病機(jī)制和治療等研究。常用的PD模型小鼠為C57BL小鼠。 MPTP可導(dǎo)致C57BL小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡，但其具體機(jī)制尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)以MPTP腹腔注射建立C57BL小鼠PD模型，通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行檢測(cè)，探討MPTP的作用機(jī)制。近期研究發(fā)現(xiàn)利福平(RFP

5、)具有抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用，但是否對(duì)動(dòng)物體內(nèi)的DA能神經(jīng)元經(jīng)MPTP處理后的細(xì)胞凋亡有抑制作用尚未見報(bào)道，而國(guó)內(nèi)關(guān)于RFP與細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)關(guān)系亦未見相關(guān)報(bào)道。本研究利用常用的MPTP致C57BL小鼠PD模型，探討RFP在PD中的神經(jīng)保護(hù)作用。 第一章帕金森病MPTP小鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變化的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 建立MPTP致C57BL小鼠PD模型，通過行為學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)方法對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行檢

6、測(cè)，探討MPTP的作用機(jī)制。 方法 取C57BL雄性小鼠16只，采用完全隨機(jī)方法隨機(jī)分為模型組(n=8)和對(duì)照組(n=8)。模型組腹腔注射30mg/kg體重的MPTP，每天1次，連續(xù)5天。對(duì)照組腹腔注射等容量生理鹽水(NS)，每天1次，連續(xù)5天。通過行為學(xué)觀察、黑質(zhì)Nissl染色及免疫組織化學(xué)染色，觀察MPTP對(duì)小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及SNcNissl、酪氨酸羥化酶(TH)、Bcl-2、Caspase-3陽性細(xì)胞的影響。

7、 結(jié)果 小鼠注射MPTP后出現(xiàn)肢體震顫、弓背、豎尾、豎毛、后肢張開、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)不穩(wěn)等改變、肢體僵硬、活動(dòng)明顯減少，精神差，個(gè)別出現(xiàn)癲癇樣發(fā)作。隨著給藥次數(shù)的增加，其運(yùn)動(dòng)減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩的表現(xiàn)越來越明顯。同時(shí)，SNc的Nissl、TH陽性細(xì)胞顯著減少(P=0.000)，Bcl-2和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P=0.000)，尤以Caspase-3陽性細(xì)胞為著，為對(duì)照組的四倍多。 結(jié)論

8、 MPTP誘發(fā)的C57BL小鼠PD模型成功率高，死亡率低，能較好地模擬PD的行為學(xué)、病理學(xué)等方面的改變，是一種較為理想的PD動(dòng)物模型。本組有些行為反應(yīng)(運(yùn)動(dòng)減少、肢體僵硬、步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩等)較文獻(xiàn)報(bào)道為重，考慮與給藥途徑、劑量、時(shí)間，對(duì)行為學(xué)改變進(jìn)行觀測(cè)的時(shí)間及C57BL小鼠亞型、性別、鼠齡等有關(guān)。MPTP誘發(fā)的C57BL小鼠PD模型中細(xì)胞凋亡可能是MPTP的主要毒性作用方式，其通過Caspase-3途徑產(chǎn)生凋亡效應(yīng)，并引起B(yǎng)c

9、l-2蛋白反應(yīng)性增高。 第二章利福平保護(hù)MPTP所致小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 建立MPTP致C57BL小鼠PD模型，在造模前或后給予RFP，通過行為學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)方法對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行檢測(cè)，觀察RFP對(duì)MPTP致PDC57BL小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 取C57BL雄性小鼠40只，采用完全隨機(jī)方法將動(dòng)物隨機(jī)分為空白組、MPTP組、MPTP+NS組、RFP預(yù)處理組

10、(RFP+MPTP組)、MPTP后RFP治療組(MPTP+RFP組)，共計(jì)5組，每組8只。MPTP用量：30mg/kg；RFP用量：5mg/kg。采用腹腔注射方法給藥。空白組不予特殊處置；MPTP組予MPTP1次/d，連用5d；MPTP+NS組給予MPTP2h后予等量NS腹腔注射1次/d，連用5d；RFP預(yù)處理組于第1-3d給予RFP1次/d，連用3d，第4-8d給予RFP2h后給予MPTP1次/d，連用5d；MPTP+RFP組在給予M

11、PTP2h后予RFP1次/d，連用5d。通過行為學(xué)觀察、黑質(zhì)Nissl染色、免疫組織化學(xué)染色，觀察RFP對(duì)PD小鼠模型的行為學(xué)表現(xiàn)及SNcNissl、TH、Bcl-2、Caspase-3陽性細(xì)胞的影響。 結(jié)果 小鼠注射MPTP后出現(xiàn)震顫、豎尾、豎毛、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、肢體僵硬，活動(dòng)明顯減少。同時(shí)，SNc的Nissl、TH陽性細(xì)胞顯著減少(P=0.000)，Bcl-2陽性細(xì)胞有所增多(P=0.000)，Caspase-3

12、陽性細(xì)胞顯著增多(P=0.000)；應(yīng)用RFP后較MPTP組癥狀減輕，Nissl、TH、Bcl-2陽性細(xì)胞增多(P＜0.01)，而Caspase-3陽性細(xì)胞減少(P=0.000)；RFP預(yù)處理組作用最為顯著(P=0.000)。 結(jié)論 應(yīng)用RFP后可明顯減輕MPTP導(dǎo)致的PD模型癥狀，顯著降低MPTP引起的Nissl、TH陽性細(xì)胞減少及Caspase-3陽性細(xì)胞增多，并導(dǎo)致Bcl-2陽性細(xì)胞顯著增多。預(yù)先應(yīng)用RFP作用更顯