微管對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能及能量代謝與電生理影響研究.pdf

1、我們對(duì)“休克心”發(fā)生機(jī)理的長(zhǎng)期研究中發(fā)現(xiàn),在心肌缺血缺氧早期,微管即發(fā)生顯著破壞,而微管在缺氧引起的一系列效應(yīng)中所起的作用及對(duì)缺氧所致的心肌細(xì)胞的能量代謝障礙的影響及其發(fā)生機(jī)制目前罕見報(bào)道。作為細(xì)胞能量供應(yīng)核心細(xì)胞器的線粒體,在缺氧條件下細(xì)胞狀態(tài)的改變中起至關(guān)重要的作用。線粒體是心肌細(xì)胞缺氧損害的核心靶細(xì)胞器,線粒體損害是“休克心”及全身性缺氧損害的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。線粒體在細(xì)胞缺氧性損害中起重要作用,不僅因其是細(xì)胞生物反應(yīng)過(guò)程重要的能量供應(yīng)

2、者,他們還能通過(guò)其膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)直接參與啟動(dòng)細(xì)胞的壞死和凋亡。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),mPTP的開放引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT),導(dǎo)致線粒體基質(zhì)膨脹、外膜破裂,凋亡信號(hào)分子從內(nèi)外膜間釋放,引起細(xì)胞的壞死和凋亡;mPTP的開放導(dǎo)致線粒體的不可逆損傷是缺氧性心肌細(xì)胞損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 而微管與線粒體之間有密切的聯(lián)系。近年來(lái),對(duì)細(xì)胞骨架的深入研究表明,微管除了作為胞內(nèi)的剛性物質(zhì),具有錨定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線粒體、高爾基體、

3、細(xì)胞核等而對(duì)細(xì)胞起穩(wěn)定性作用外,還參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等。細(xì)胞骨架除了對(duì)線粒體胞內(nèi)定位及分布起一定作用外,還可能參與線粒體呼吸功能的調(diào)節(jié)過(guò)程。我們前期在乳鼠心肌細(xì)胞缺氧的研究中發(fā)現(xiàn),缺氧條件下微管破壞可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔MPTP的持續(xù)開放,進(jìn)而使線粒體呼吸功能下降,提示微管對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞線粒體具有重要的調(diào)節(jié)作用,而這一具體調(diào)控環(huán)節(jié)尚不清楚。由于VDAC是MPTP在線粒體外膜上的通道蛋白,故我們推測(cè),微管可能是通過(guò)某種

4、未知機(jī)制對(duì)VDAC的開放狀態(tài)產(chǎn)生影響。通過(guò)上述途徑改變,微管影響了細(xì)胞的產(chǎn)能,進(jìn)一步使得心肌細(xì)胞的功能產(chǎn)生各種不同的影響。
　　 作為心肌細(xì)胞,在功能研究中,最重要的是其電生理活性,與能量代謝息息相關(guān),破壞微管后,大鼠成體心肌細(xì)胞的電生理活性改變,罕見報(bào)道。
　　 在心臟缺氧的實(shí)驗(yàn)研究中,大鼠成體心肌細(xì)胞與乳鼠心肌細(xì)胞相比,存在顯著的差異,由于成體心肌細(xì)胞已經(jīng)分化成熟,其自我修復(fù)能力遠(yuǎn)較乳鼠細(xì)胞差,其對(duì)缺氧的代償能力也較

5、差。在活性及功能研究方面,成體細(xì)胞更加接近整體水平,其結(jié)果更具有說(shuō)服力。對(duì)原代培養(yǎng)的成體心肌細(xì)胞而言,容易受外界各種環(huán)境影響,故培養(yǎng)的難度較大,但對(duì)缺氧及各種實(shí)驗(yàn)施加因素更為敏感。另外原代培養(yǎng)的成體心肌細(xì)胞背景更加一致,試驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可信度高。在其結(jié)構(gòu)、功能方面則區(qū)別更大,其線粒體的分布更加具有規(guī)律,各項(xiàng)電生理及收縮功能發(fā)育完善,有利于深入的機(jī)理研究?；谏鲜鎏攸c(diǎn),本研究采用大鼠成體心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象,并利用一定濃度的秋水仙堿固定時(shí)間

6、處理細(xì)胞,模擬缺氧條件下的微管解聚狀態(tài),作為單一實(shí)驗(yàn)處理因素,觀察大鼠成體心肌細(xì)胞的各種指標(biāo)變化,以分析單純微管解聚所引起的各種變化。
　　 本研究假設(shè):微管破壞可能通過(guò)改變線粒體的亞細(xì)胞定位;通過(guò)某中間微管相互作用蛋白分子對(duì)VDAC進(jìn)行調(diào)控,使VDAC開放增加,線粒體活性下降,兩條途徑加重心肌細(xì)胞能量代謝障礙,進(jìn)而使其功能產(chǎn)生改變,細(xì)胞膜電生理活性下降。
　　 研究目的
　　 應(yīng)用微管解聚劑模擬缺氧條件下微管的

7、破壞,研究微管解聚對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能及能量代謝與電生理的影響,分析其可能機(jī)制,深入探討微管解聚在缺氧過(guò)程中的作用。
　　 材料和方法
　　 1、成年大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)
　　 2、利用8μM微管解聚劑秋水仙堿(colchicine)作用于大鼠成體心肌細(xì)胞,模擬缺氧引發(fā)的微管解聚狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)分組為正常對(duì)照組(N組)及紫杉醇微管解聚組(C組)。
　　 3、利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察N組、C組心肌細(xì)胞聚合態(tài)微管、線粒

8、體形態(tài)及分布變化規(guī)律,Western blot法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞聚合態(tài)微管蛋白含量變化。
　　 4、利用四甲基羅丹明乙酯(TMRE)檢測(cè)線粒體內(nèi)膜電位;使用免疫印記法檢測(cè)胞漿中細(xì)胞色素c含量變化;運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性;運(yùn)用乳酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度。
　　 5、高效液相色譜測(cè)定心肌細(xì)胞中ATP、ADP、AMP含量。
　　 6、利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),以VDAC為誘餌在肝細(xì)胞文庫(kù)中篩選可能與其有相互作

9、用的蛋白,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證,并對(duì)篩選出的蛋白進(jìn)行免疫組化細(xì)胞共定位研究;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)研究。
　　 7、應(yīng)用膜片鉗技術(shù)全細(xì)胞紀(jì)錄方法,紀(jì)錄心肌細(xì)胞膜電容、動(dòng)作電位、鈉電流(Ina)、鈣電流(Ica),并應(yīng)用Axon公司的pClamp8.1軟件中的Clampit進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 主要結(jié)果
　　 1、正常乳鼠心肌細(xì)胞微管圍繞核周呈放射狀排列,微管管狀結(jié)構(gòu)清晰。正常大鼠成體心肌細(xì)胞微管部分圍

10、繞核周排列,其他呈線性沿細(xì)胞長(zhǎng)軸方向平行排列。C組乳鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)遭受破壞,大鼠成體心肌細(xì)胞微管沿肌小節(jié)縱軸方向規(guī)律排列破壞,表現(xiàn)為免疫熒光強(qiáng)度減弱,微管結(jié)構(gòu)的連續(xù)性喪失,變得粗糙且不光滑,微管結(jié)構(gòu)不清晰,且呈特征性卷曲狀結(jié)構(gòu)。WB結(jié)果顯示:C組心肌細(xì)胞聚合態(tài)微管蛋白含量較N組明顯減少;成體心肌細(xì)胞減少程度較乳鼠有顯著增加。
　　 2、正常成體心肌細(xì)胞線粒體呈橢圓或長(zhǎng)桿狀,沿細(xì)胞長(zhǎng)軸分布,與各肌束間呈線性均勻分布。大鼠成

11、體心肌細(xì)胞微管呈線性管狀分布,與心肌纖維方向平行,VDAC顯示的線粒體呈顆粒裝分布,其分布方向與微管相同,并重疊其上,提示成體心肌細(xì)胞線粒體沿微管分布。C組線粒體的分布散亂,失去規(guī)律性。
　　 3、C組線粒體內(nèi)膜電位較N組明顯降低,表現(xiàn)為線粒體熒光強(qiáng)度減弱;C組心肌細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C含量較正常對(duì)照明顯增高。
　　 4、微管解聚后心肌細(xì)胞與正常對(duì)照相比ATP含量下降、ADP、AMP含量上升,ADP/ATP明顯升高,能荷下

12、降;細(xì)胞活性明顯降低;心肌細(xì)胞內(nèi)乳酸含量下降。
　　 5、應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),在人肝臟文庫(kù)中篩選出VDAC的可能相互作用蛋白為DYNL1、PTPRH,經(jīng)酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)VDAC-DYNL1,VDAC-PTPRH的兩對(duì)相互作用分子,目前未見報(bào)道,為新的可能存在的相互作用蛋白,DYNL1與微管有明確的相互作用。
　　 6、與N組相比較,C組靜息電位(rest potential,

13、RP)無(wú)顯著變化;而連續(xù)動(dòng)作電位(action potential,AP)的形狀發(fā)生顯著改變,N組心肌細(xì)胞連續(xù)AP形態(tài)一致,動(dòng)作電位振幅(action potential amplitude,AMP)峰值一致,復(fù)極化時(shí)動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間(actionpotential duration,APD)APD時(shí)長(zhǎng)一致,C組AP形態(tài)不穩(wěn)定,AMP峰值大小不一,APD時(shí)長(zhǎng)明顯減小。微管解聚組APD20、APD50和APD90較對(duì)照組明顯縮短。

14、　　 7、微管解聚后Ina電流顯著增加;I/V曲線結(jié)果提示微管解聚組電流密度在一50～-20 mV的電壓范圍內(nèi)均明顯高于正常對(duì)照組。兩組Ica電流密度一電壓曲線均一致,幾乎重疊,微管解聚組與對(duì)照組組間無(wú)明顯差別。Ica有明顯的電壓依賴性,去極化電壓正于-40mV時(shí)Ica被激活,去極化電壓至-10mV時(shí)Ica最大。
　　 討論與結(jié)論
　　 1、微管與線粒體在成體心肌細(xì)胞內(nèi)分布方向一致。微管解聚后心肌細(xì)胞線粒體的排列分布規(guī)

15、律紊亂。
　　 2、微管解聚使大鼠成體心肌細(xì)胞活性顯著下降,推測(cè)為微管解聚使細(xì)胞內(nèi)能量生成單元崩解,降低了心肌細(xì)胞的能量供應(yīng)。
　　 3、微管解聚使心肌細(xì)胞線粒體膜電位降低,細(xì)胞色素C漏出增加,表明微管對(duì)線粒體VDAC存在調(diào)控作用。
　　 4、微管解聚抑制心肌細(xì)胞糖酵解。心肌細(xì)胞內(nèi)糖酵解酶依附于微管,按照一定比例及次序排列,構(gòu)成最佳的快速產(chǎn)能效應(yīng)。微管解聚后,這種規(guī)律排列遭到嚴(yán)重破壞,糖酵解產(chǎn)能效率受到抑制,故能

16、量生成減少,相應(yīng)乳酸生成減少。
　　 5、應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),在人肝臟文庫(kù)中篩選出VDAC的可能相互作用蛋白為DYNL1、PTPRH,經(jīng)酵母回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性。生物信息學(xué)分析結(jié)果提示,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)VDAC-DYNL1,VDAC-PTPRH的兩對(duì)相互作用分子,目前未見報(bào)道,為新的可能存在的相互作用蛋白,DYNL1與微管有明確的相互作用。DYNL1可能為微管對(duì)線粒體VDAC進(jìn)行調(diào)控作用的中間蛋白。PTPRH可能對(duì)線粒體VDAC具有