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文檔簡介
1、肌肉中肌內(nèi)脂肪沉積與多種肉質性狀相關,如嫩度、多汁性、風味和系水力。為了迎合消費者對高肉質不斷增加的需求,提高肌內(nèi)脂肪含量已經(jīng)成為全世界育種工作者的目標之一。然而,在過去幾十年中,由于人們對肉雞生長速度和飼料利用率遺傳選擇的過度追求,導致目前雞肉質量和風味降低。與此同時,對肉雞生長速度的過度選擇伴隨著腹部脂肪的過度積累,因此,增加肌內(nèi)脂肪同時減少腹部脂肪沉積已經(jīng)成為目前肉雞育種工作的目標之一。本研究一方面旨在利用RNA-seq技術描述雞
2、腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞在成脂分化過程中的轉錄組表達情況,鑒定兩種細胞中的lncRNAs,并分析lncRNAs的特點。一方面篩選雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中的差異表達基因,結合生物信息學方法,鑒定出可能影響雞腹部和肌內(nèi)脂肪沉積的重要因子和信號通路。最后,通過比較雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中基因的表達水平,研究雞腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞分化過程中轉錄組水平上的差異。主要研究結果如下:
1.雞腹部脂肪沉積關鍵基因的
3、篩選
由雞腹部脂肪組織分離培養(yǎng)獲得雞原代腹部脂肪前體細胞,誘導其成脂分化,油紅O染色顯示,成功分離獲得雞腹部脂肪前體細胞。在雞腹部脂肪前體細胞成脂分化過程中共鑒定出27,023條lncRNAs,分析顯示,雞腹部脂肪前體細胞中的lncRNAs具有序列和開放閱讀框短及外顯子少的特點;功能預測發(fā)現(xiàn),雞腹部脂肪前體細胞中的lncRNAs主要參與蛋白修飾、細胞蛋白修飾和信號調控等生物學過程。在雞腹部脂肪前體細胞成脂分化過程中共篩選到4,
4、232條差異表達lncRNAs和1,656條差異表達mRNAs;功能注釋顯示,差異表達基因主要富集在細胞周期、間葉細胞分化和細胞周期過程等生物學過程;通路分析結果顯示,差異表達基因顯著富集在細胞周期、DNA復制和PPAR等信號通路中。共表達分析共鑒定出了6個階段特異性模塊,并利用可視化在6個模塊中篩選出了29個高連通性的基因,這些基因可能為調控雞腹部脂肪前體細胞成脂分化的重要候選基因,包括XLOC_052948、gga-mir-30c、
5、SCD和KLF15等基因。
2.雞肌內(nèi)脂肪沉積關鍵基因的篩選
由雞胸部肌肉組織分離培養(yǎng)獲得雞原代肌內(nèi)脂肪前體細胞,誘導其成脂分化,油紅O染色顯示,成功分離獲得雞肌內(nèi)脂肪前體細胞。在雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中共鑒定出26,172條lncRNAs,分析顯示,雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中的lncRNAs具有序列和開放閱讀框短及外顯子少的特點;功能預測發(fā)現(xiàn),雞肌內(nèi)脂肪前體細胞中的lncRNAs主要參與基因表達、細胞學大分子合成、RNA代謝
6、等生物學過程。在雞肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化過程中共篩選到4,694條差異表達lncRNAs和2,169條差異表達mRNAs;功能注釋顯示,差異表達基因主要富集在信號調控、細胞通信調控及信號轉導調控等生物學過程,通路分析結果顯示,差異表達基因顯著富集在焦點黏連、MAPK及PPAR等信號通路中。共表達分析共鑒定出了6個階段特異性模塊,可視化分析在6個階段特異性模塊中篩選出了28個高連通性的基因,這些基因可能為調控雞肌內(nèi)脂肪前體細胞成脂分化的
7、重要候選基因,包括XLOC_013577、gga-mir-146b、BMP3和MYOD1等基因。
3.雞腹部和肌內(nèi)脂肪沉積機制比較分析
腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞間lncRNAs結構比較分析顯示,兩種細胞lncRNAs具有相同的特點,即外顯子數(shù)少、開放閱讀框短和序列短。表達量比較顯示,兩種細胞lncRNAs的表達量均遠遠低于mRNAs。轉錄組比較分析顯示,兩種細胞間差異基因隨著分化的延長而減少,在分化第0、2、4和6天,
8、分別篩選到2,942(1,877個mRNAs和1,065個lncRNAs)、3,788(1,964個mRNAs和1,824個lncRNAs)、2,872(1,194個mRNAs和1,678個lncRNAs)和2,214(1,206個mRNAs和1,008個lncRNAs)個差異表達基因。異表達基因GO注釋顯示,在分化第0天,腹部和肌內(nèi)脂肪前體細胞之間差異表達基因主要顯著富集在生長因子應答、生長因子刺激細胞應答及細胞運動性調控等生物學過程
9、;在分化第2天,差異表達基因主要顯著富集在肌肉結構發(fā)育、肌肉器官發(fā)育和生長因子細胞學應答等生物學過程中;在分化第4天,差異基因主要顯著富集在間充質細胞分化、細胞遷移調控和細胞粘附等生物學過程中;細胞學組分分析顯;在分化第6天時,差異基因主要顯著富集在酶聯(lián)受體蛋白信號通路、運動和細胞定位等生物學過程中。Pathway分析顯示,差異表達基因顯著富集到了4條已知與脂肪前體細胞分化相關的信號通路,如PPAR和甘油酯代謝通路等。最后,我們比較了兩
10、種細胞成脂分化過程中的差異表達基因,結果顯示,兩種細胞間僅有253個共有的差異表達lncRNAs,而差異表達mRNAs則達到了911個。共有基因顯著富集到了包括細胞周期、細胞周期過程、染色體分離等在內(nèi)的超過200個生物學過程中;通路分析顯示,共有差異基因顯著富集到了包括細胞周期、細胞外基質-受體相互作用和焦點粘連等在內(nèi)的數(shù)十條信號通路,其中包括多條已知參與脂肪生成調控的信號通路,如PPAR、p53、Foxo和TGF-beta信號通路。<
11、br> 4.gga-mir-30c-2與XLOC_060155和SIX4基因靶關系驗證
高通量測序和基因共表達結果顯示,XLOC_060155、gga-mir-30c和SIX4為調控雞腹部脂肪前體細胞成脂分化的重要候選基因,XLOC_060155與gga-mir-30c及gga-mir-30c與SIX4基因的表達模式具有高度相關性。RT-qPCR結果顯示,XLOC_060155的表達模式與gga-mir-30c呈顯著負相關(
12、r=-0.97,P<0.01),gga-mir-30c的表達模式與SIX4基因呈顯著負相關(r=-0.684,P=0.014<0.05)。靶基因預測顯示,SIX4和XLOC_060155基因存在gga-mir-30c-5p的結合位點。雙熒光素酶活性檢測結果顯示,gga-mir-30c-5p與XLOC_060155結合后熒光素酶的表達活性顯著降低,而將結合位點突變后,熒光素酶表達活性極顯著回升;gga-mir-30c-5p與SIX43'U
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