豬脂肪沉積關(guān)鍵基因的篩選及新基因pFAM134B的功能鑒定.pdf

1、脂肪是評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，其中肌內(nèi)脂肪含量直接影響豬肉的色澤、風(fēng)味、嫩度、持水力等肉質(zhì)指標(biāo)，而皮下脂肪也直接關(guān)系到經(jīng)濟(jì)價(jià)值與肉用品質(zhì)，如何在降低皮下脂肪沉積的同時(shí)增加肌內(nèi)脂肪含量成為肉質(zhì)調(diào)控的關(guān)鍵問題。我國(guó)地方優(yōu)良地方品種豬金華豬肌內(nèi)脂肪含量高、肉色紅潤(rùn)，但是皮下脂肪含量高，生長(zhǎng)緩慢。因此本研究以金華豬和肌內(nèi)脂肪含量少且皮下脂肪薄的瘦肉型長(zhǎng)白豬為試驗(yàn)動(dòng)物模型，通過基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)獲得金華豬和長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌以及皮下

2、脂肪基因差異表達(dá)譜，篩選出差異表達(dá)基因pFAM134B，通過RACE克隆技術(shù)克隆得到新基因pFAM134B的cDNA全長(zhǎng)，研究該基因在肝臟、大腦、背最長(zhǎng)肌以及皮下脂肪中的表達(dá)差異及規(guī)律，并利用RNAi技術(shù)和基因超表達(dá)技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上初步鑒定pFAM134B基因調(diào)控豬脂肪沉積的內(nèi)在機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)一金華豬、長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪基因表達(dá)譜差異研究
　　 利用基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)研究30和90日齡金華豬與長(zhǎng)白

3、豬背最長(zhǎng)肌和皮下脂肪的基因表達(dá)差異?；虮磉_(dá)譜差異研究結(jié)果顯示，與長(zhǎng)白豬相比，30日齡金華豬背最長(zhǎng)肌中顯著高表達(dá)基因有177個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有199個(gè);90日齡顯著高表達(dá)基因有276個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有155個(gè)。30日齡金華豬皮下脂肪顯著高表達(dá)基因有188個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有147個(gè);90日齡顯著高表達(dá)基因有235個(gè)，顯著低表達(dá)的基因有223個(gè)。金華豬背最長(zhǎng)肌在30和90日齡都顯著高表達(dá)的基因14個(gè)，顯著低表達(dá)的基因11個(gè);金華

4、豬皮下脂肪在30和90日齡都顯著高表達(dá)的基因38個(gè)，顯著低表達(dá)的基因18個(gè).進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析可知，金華豬背最長(zhǎng)肌、皮下脂肪中顯著高表達(dá)的差異基因主要為脂肪代謝相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子，表明金華豬脂肪沉積能力明顯強(qiáng)于長(zhǎng)白豬。
　　 實(shí)驗(yàn)二豬脂肪沉積關(guān)鍵新功能基因pFAM134B的篩選、克隆及序列分析
　　 根據(jù)金華豬肌內(nèi)脂肪含量以及皮下脂肪在90日齡顯著增加的趨勢(shì)，在上述差異表達(dá)的基因中，篩選得到一個(gè)在90日齡時(shí)皮下脂肪

5、以及背最長(zhǎng)肌中都顯著高表達(dá)的基因，其EST序列編號(hào)為BF702245。根據(jù)已知的EST序列，通過RACE技術(shù)，克隆得到其基因全長(zhǎng)cDNA序列2889bp，其中包括179bp5’非編碼區(qū)、978 bp編碼區(qū)和1732bp的3’非編碼區(qū)，編碼區(qū)翻譯325個(gè)氨基酸;BLAST結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與人、鼠FAM134B基因同源性皆為84％，因此將此基因命名為豬FAM134B基因即為porcine FAM134B(pFAM134B)。

6、
　　 實(shí)驗(yàn)三pFAM134B基因的組織表達(dá)規(guī)律及品種差異研究
　　 pFAM134B表達(dá)的組織特異性研究結(jié)果表明，pFAM134B mRNA表達(dá)水平在金華豬和長(zhǎng)白豬中都是肝臟中最高，其次為皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌，大腦中表達(dá)量最低，肝臟和脂肪組織是脂肪合成的主要場(chǎng)所，pFAM134B在肝臟和皮下脂肪中高表達(dá)，說明pFAM134B可能參與脂肪代謝的調(diào)控。不同生長(zhǎng)階段表達(dá)規(guī)律研究結(jié)果表明，在肝臟、皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌中，pFAM1

7、34B基因的表達(dá)都是隨著日齡的增長(zhǎng)而升高，在90-120日齡間有略微下降，但在大腦中無明顯表達(dá)規(guī)律。品種差異研究結(jié)果表明，在皮下脂肪和背最長(zhǎng)肌中，長(zhǎng)白豬pFAM134B基因表達(dá)量在60日齡前高于金華豬，在90日齡后顯著低于金華豬;金華豬大腦中pFAM134B基因表達(dá)量高于長(zhǎng)白豬，且在90日齡后達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果與金華豬肌內(nèi)脂肪含量以及體脂率的變化規(guī)律基本一致，這表明，pFAM134B的表達(dá)可能與豬脂肪沉積密切相關(guān)。
　　 實(shí)

8、驗(yàn)四pFAM134B對(duì)肌內(nèi)脂肪沉積的影響及機(jī)制研究
　　 本試驗(yàn)通過豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)，有效結(jié)合RNAi技術(shù)和基因超表達(dá)技術(shù)等研究豬新基因pFAM134B調(diào)控脂肪沉積的分子機(jī)制.首先通過RNAi技術(shù)，篩選獲得了pFAM134B基因的有效siRNA表達(dá)載體fs3，經(jīng)干擾條件優(yōu)化以及G418的穩(wěn)定篩選后干擾效果達(dá)到65.0％，轉(zhuǎn)染至肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞后，與對(duì)照組相比顯著降低了脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因PPARγ以及脂肪合成關(guān)鍵基因FA

9、S和ACC基因的表達(dá)(p＜0.05)，增強(qiáng)了脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達(dá)以及促進(jìn)脂肪動(dòng)員的Sirt1基因的表達(dá)(p＜0.05)，降低了脂肪細(xì)胞中甘油三酯的含量，結(jié)果表明抑制pFAM134B基因表達(dá)后，降低了脂肪細(xì)胞分化以及脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)，增強(qiáng)了脂肪分解代謝關(guān)鍵功能基因表達(dá)，顯著降低肌內(nèi)脂肪的沉積。進(jìn)一步構(gòu)建了該基因的超表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)pFAM134B基因，顯著增加了脂肪合成關(guān)

10、鍵基因FAS和ACC基因以及PPARγ的表達(dá)(p＜0.05)，降低了脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因以及Sirt1的表達(dá)(p＜0.05)，增加了肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中甘油三酯的沉積(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中游離脂肪酸的含量(p＜0.05)，與干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。上述結(jié)果表明，pFAM134B基因可正調(diào)控肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化基因以及脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因的表達(dá)，可促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化，增強(qiáng)脂肪合成速率，進(jìn)而增強(qiáng)肌內(nèi)脂肪的沉積。
　　

11、 實(shí)驗(yàn)五pFAM134B對(duì)皮下脂肪沉積的影響及機(jī)制研究
　　 本試驗(yàn)通過豬皮下前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)，結(jié)合RNAi技術(shù)和基因超表達(dá)技術(shù)等研究豬新基因pFAM134B調(diào)控皮下脂肪沉積的分子機(jī)制。首先通過RNAi技術(shù)，篩選獲得了pFAM134B基因的有效siRNA表達(dá)載體fs3，經(jīng)干擾條件優(yōu)化以及G418的穩(wěn)定篩選后干擾效果達(dá)到74.5％，顯著升高了脂肪細(xì)胞分化基因PPARγ以及脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL、HSL和促進(jìn)脂肪動(dòng)員的Sirt1

12、基因的表達(dá)(p＜0.05)，降低了脂肪合成關(guān)鍵基因ACC和FAS基因的表達(dá)(p＜0.05)，顯著降低了脂肪細(xì)胞中甘油的含量，結(jié)果表明抑制pFAM134B基因表達(dá)可降低皮下脂肪的沉積。進(jìn)一步在皮下前體脂肪細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)該基因，結(jié)果表明，皮下脂肪細(xì)胞中脂肪合成關(guān)鍵基因FAS和ACC基因表達(dá)量顯著升高(p＜0.05)，脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達(dá)顯著降低(p＜0.05)，但同時(shí)也顯著降低了PPARγ基因的表達(dá)，促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中甘油

13、三酯的沉積(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中游離脂肪酸的含量(p＜0.05)。以上結(jié)果表明，pFAM134B基因在皮下脂肪細(xì)胞中主要是通過正調(diào)控脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因的表達(dá)，增強(qiáng)脂肪合成速率來實(shí)現(xiàn)脂肪沉積的，細(xì)胞分化在此過程中無明顯作用，推測(cè)皮下脂肪的沉積主要源于脂肪細(xì)胞的膨大并非脂肪細(xì)胞的分化增殖。
　　 綜上所述，本研究獲得了金華豬和長(zhǎng)白豬在30和90日齡背最長(zhǎng)肌及皮下脂肪基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，篩選并克隆獲得了豬脂肪沉積新功能基因