豬脂肪沉積關(guān)鍵基因的篩選及新基因pFAM134B的功能鑒定.pdf

1、脂肪是評價豬肉品質(zhì)的一個關(guān)鍵指標，其中肌內(nèi)脂肪含量直接影響豬肉的色澤、風味、嫩度、持水力等肉質(zhì)指標，而皮下脂肪也直接關(guān)系到經(jīng)濟價值與肉用品質(zhì)，如何在降低皮下脂肪沉積的同時增加肌內(nèi)脂肪含量成為肉質(zhì)調(diào)控的關(guān)鍵問題。我國地方優(yōu)良地方品種豬金華豬肌內(nèi)脂肪含量高、肉色紅潤，但是皮下脂肪含量高，生長緩慢。因此本研究以金華豬和肌內(nèi)脂肪含量少且皮下脂肪薄的瘦肉型長白豬為試驗動物模型，通過基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)獲得金華豬和長白豬背最長肌以及皮下

2、脂肪基因差異表達譜，篩選出差異表達基因pFAM134B，通過RACE克隆技術(shù)克隆得到新基因pFAM134B的cDNA全長，研究該基因在肝臟、大腦、背最長肌以及皮下脂肪中的表達差異及規(guī)律，并利用RNAi技術(shù)和基因超表達技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上初步鑒定pFAM134B基因調(diào)控豬脂肪沉積的內(nèi)在機制。
　　 實驗一金華豬、長白豬背最長肌和皮下脂肪基因表達譜差異研究
　　 利用基因芯片技術(shù)、生物信息學(xué)分析技術(shù)研究30和90日齡金華豬與長白

3、豬背最長肌和皮下脂肪的基因表達差異?；虮磉_譜差異研究結(jié)果顯示，與長白豬相比，30日齡金華豬背最長肌中顯著高表達基因有177個，顯著低表達的基因有199個;90日齡顯著高表達基因有276個，顯著低表達的基因有155個。30日齡金華豬皮下脂肪顯著高表達基因有188個，顯著低表達的基因有147個;90日齡顯著高表達基因有235個，顯著低表達的基因有223個。金華豬背最長肌在30和90日齡都顯著高表達的基因14個，顯著低表達的基因11個;金華

4、豬皮下脂肪在30和90日齡都顯著高表達的基因38個，顯著低表達的基因18個.進一步通過生物信息學(xué)分析可知，金華豬背最長肌、皮下脂肪中顯著高表達的差異基因主要為脂肪代謝相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子，表明金華豬脂肪沉積能力明顯強于長白豬。
　　 實驗二豬脂肪沉積關(guān)鍵新功能基因pFAM134B的篩選、克隆及序列分析
　　 根據(jù)金華豬肌內(nèi)脂肪含量以及皮下脂肪在90日齡顯著增加的趨勢，在上述差異表達的基因中，篩選得到一個在90日齡時皮下脂肪

5、以及背最長肌中都顯著高表達的基因，其EST序列編號為BF702245。根據(jù)已知的EST序列，通過RACE技術(shù)，克隆得到其基因全長cDNA序列2889bp，其中包括179bp5’非編碼區(qū)、978 bp編碼區(qū)和1732bp的3’非編碼區(qū)，編碼區(qū)翻譯325個氨基酸;BLAST結(jié)果表明，該基因編碼的氨基酸序列與人、鼠FAM134B基因同源性皆為84％，因此將此基因命名為豬FAM134B基因即為porcine FAM134B(pFAM134B)。

6、
　　 實驗三pFAM134B基因的組織表達規(guī)律及品種差異研究
　　 pFAM134B表達的組織特異性研究結(jié)果表明，pFAM134B mRNA表達水平在金華豬和長白豬中都是肝臟中最高，其次為皮下脂肪和背最長肌，大腦中表達量最低，肝臟和脂肪組織是脂肪合成的主要場所，pFAM134B在肝臟和皮下脂肪中高表達，說明pFAM134B可能參與脂肪代謝的調(diào)控。不同生長階段表達規(guī)律研究結(jié)果表明，在肝臟、皮下脂肪和背最長肌中，pFAM1

7、34B基因的表達都是隨著日齡的增長而升高，在90-120日齡間有略微下降，但在大腦中無明顯表達規(guī)律。品種差異研究結(jié)果表明，在皮下脂肪和背最長肌中，長白豬pFAM134B基因表達量在60日齡前高于金華豬，在90日齡后顯著低于金華豬;金華豬大腦中pFAM134B基因表達量高于長白豬，且在90日齡后達到顯著水平。以上結(jié)果與金華豬肌內(nèi)脂肪含量以及體脂率的變化規(guī)律基本一致，這表明，pFAM134B的表達可能與豬脂肪沉積密切相關(guān)。
　　 實

8、驗四pFAM134B對肌內(nèi)脂肪沉積的影響及機制研究
　　 本試驗通過豬肌內(nèi)前體脂肪細胞的培養(yǎng)，有效結(jié)合RNAi技術(shù)和基因超表達技術(shù)等研究豬新基因pFAM134B調(diào)控脂肪沉積的分子機制.首先通過RNAi技術(shù)，篩選獲得了pFAM134B基因的有效siRNA表達載體fs3，經(jīng)干擾條件優(yōu)化以及G418的穩(wěn)定篩選后干擾效果達到65.0％，轉(zhuǎn)染至肌內(nèi)前體脂肪細胞后，與對照組相比顯著降低了脂肪細胞分化關(guān)鍵基因PPARγ以及脂肪合成關(guān)鍵基因FA

9、S和ACC基因的表達(p＜0.05)，增強了脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達以及促進脂肪動員的Sirt1基因的表達(p＜0.05)，降低了脂肪細胞中甘油三酯的含量，結(jié)果表明抑制pFAM134B基因表達后，降低了脂肪細胞分化以及脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因表達，增強了脂肪分解代謝關(guān)鍵功能基因表達，顯著降低肌內(nèi)脂肪的沉積。進一步構(gòu)建了該基因的超表達載體，實驗結(jié)果表明，在肌內(nèi)前體脂肪細胞內(nèi)超表達pFAM134B基因，顯著增加了脂肪合成關(guān)

10、鍵基因FAS和ACC基因以及PPARγ的表達(p＜0.05)，降低了脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因以及Sirt1的表達(p＜0.05)，增加了肌內(nèi)脂肪細胞中甘油三酯的沉積(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中游離脂肪酸的含量(p＜0.05)，與干擾實驗結(jié)果相反。上述結(jié)果表明，pFAM134B基因可正調(diào)控肌內(nèi)脂肪細胞分化基因以及脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因的表達，可促進肌內(nèi)脂肪細胞分化，增強脂肪合成速率，進而增強肌內(nèi)脂肪的沉積。
　　

11、 實驗五pFAM134B對皮下脂肪沉積的影響及機制研究
　　 本試驗通過豬皮下前體脂肪細胞的培養(yǎng)，結(jié)合RNAi技術(shù)和基因超表達技術(shù)等研究豬新基因pFAM134B調(diào)控皮下脂肪沉積的分子機制。首先通過RNAi技術(shù)，篩選獲得了pFAM134B基因的有效siRNA表達載體fs3，經(jīng)干擾條件優(yōu)化以及G418的穩(wěn)定篩選后干擾效果達到74.5％，顯著升高了脂肪細胞分化基因PPARγ以及脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL、HSL和促進脂肪動員的Sirt1

12、基因的表達(p＜0.05)，降低了脂肪合成關(guān)鍵基因ACC和FAS基因的表達(p＜0.05)，顯著降低了脂肪細胞中甘油的含量，結(jié)果表明抑制pFAM134B基因表達可降低皮下脂肪的沉積。進一步在皮下前體脂肪細胞內(nèi)超表達該基因，結(jié)果表明，皮下脂肪細胞中脂肪合成關(guān)鍵基因FAS和ACC基因表達量顯著升高(p＜0.05)，脂肪分解關(guān)鍵基因ATGL和HSL基因的表達顯著降低(p＜0.05)，但同時也顯著降低了PPARγ基因的表達，促進了脂肪細胞中甘油

13、三酯的沉積(p＜0.05)，降低了培養(yǎng)基中游離脂肪酸的含量(p＜0.05)。以上結(jié)果表明，pFAM134B基因在皮下脂肪細胞中主要是通過正調(diào)控脂肪合成代謝關(guān)鍵功能基因的表達，增強脂肪合成速率來實現(xiàn)脂肪沉積的，細胞分化在此過程中無明顯作用，推測皮下脂肪的沉積主要源于脂肪細胞的膨大并非脂肪細胞的分化增殖。
　　 綜上所述，本研究獲得了金華豬和長白豬在30和90日齡背最長肌及皮下脂肪基因轉(zhuǎn)錄表達譜，篩選并克隆獲得了豬脂肪沉積新功能基因