傷寒沙門菌接合性質(zhì)粒pRST98在動物體內(nèi)外對細菌生物膜形成的影響.pdf

1、目的：研究傷寒沙門菌接合性質(zhì)粒pRST98在體內(nèi)外對細菌生物膜(biofilm, BF)形成的影響,為預(yù)防和治療BF相關(guān)性疾病及新型抗菌藥物研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：⑴實驗菌株包括攜帶一長度為100 kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar typhimurium, S.typhimurium)標準毒株χ3306、毒力質(zhì)粒消除所得的S.typhimurium突變株χ3337、大腸

2、埃希菌(Escherichia coli, E.coli)K12W1485和質(zhì)粒pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入S.typhimuriumχ3337和E.coli K12W1485后分別形成的接合子χ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98。按照實驗室既往實驗已確定的BF形成的適宜溫度和時間,將受試菌分別在96孔板和24孔板中30℃培養(yǎng)3 d后,結(jié)晶紫染色半定量法、掃描電鏡(scanning electron mi

3、croscopy, SEM)和共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)分析和比較受試菌BF形成的情況。⑵課題組前期研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌接合性質(zhì)粒pRST98在動物體內(nèi)外可在一定程度上促進IL-10的產(chǎn)生。為探討IL-10對細菌BF形成的影響,在鼠傷寒沙門菌培養(yǎng)液中分別加入濃度為1 ng/ml、10 ng/ml和100 ng/ml的IL-10,并設(shè)不加IL-10的對照組,30℃

4、培養(yǎng)3 d,用上述方法分析BF形成的差異。⑶由于傷寒沙門菌具有嚴格的宿主專一性,只感染人,缺乏相應(yīng)的動物模型。本部分選取了與傷寒沙門菌親緣關(guān)系非常接近的鼠傷寒沙門菌作為研究對象,在動物體內(nèi)研究了pRST98與BF形成的關(guān)系,為實時動態(tài)監(jiān)測細菌在體內(nèi)的播散情況,本實驗室前期構(gòu)建了將熒光素酶報告基因lux導(dǎo)入并整合到細菌染色體的生物發(fā)光菌。動物實驗前首先分析了生物發(fā)光菌χ3337lux/pRST98、χ3337lux和不攜帶lux的χ333

5、7/pRST98、χ3337的生長曲線及BF形成的差異。然后將6-8周BALB/c小鼠皮下注射結(jié)腸癌細胞 CT26建立荷瘤小鼠,尾靜脈注射生物發(fā)光菌S.typhimuriumχ3337lux/pRST98和χ3337lux,用感染χ3337lux/pRST98的非荷瘤小鼠做對照組。多模式小動物活體成像系統(tǒng)(In-Vivo Imaging System, IVIS)下實時動態(tài)觀察小鼠感染后1d、2d和3d受試菌在體內(nèi)的播散情況;于感染的第

6、3d解剖小鼠,收集腫瘤、肝臟和脾臟,SEM觀察腫瘤表面BF的形成情況;觀察臟器形態(tài)學變化;平板菌落計數(shù)法檢測腫瘤、肝臟和脾臟的集落形成單位(colony-forming unit, CFU);將小鼠眼眶取血后,酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定血清中IL-10的表達量。
　　結(jié)果：①pRST98對細菌生物膜形成的影響:結(jié)晶紫染色、SEM及CLSM觀察, S.ty

7、phimuriumχ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98細菌聚集成團,構(gòu)成三維立體結(jié)構(gòu)的較厚的BF,而不攜帶該質(zhì)粒的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coli K12W1485呈零散狀分布于視野中,不形成或較少形成BF;BF形成半定量結(jié)果顯示,攜帶pRST98的S.typhimuriumχ3337/pRST98和E.coli K12W1485/pRST98的OD570值大于不攜帶該質(zhì)粒

8、的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coli K12W1485,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);S.typhimuriumχ3306和χ3337的BF形成沒有明顯差異(P>0.05)。②pRST98在不同宿主菌中BF形成能力的差異:結(jié)晶紫染色半定量法顯示E.coli K12W1485/pRST98形成BF能力明顯低于S.typhimuriumχ3337/pRST98,OD570值有統(tǒng)計學差異(P<0.05);SE

9、M和CLSM結(jié)果亦顯示在S.typhimurium中pRST98對BF形成的促進作用強于在E.coli中的作用。③不同濃度IL-10對BF形成的影響:與不加IL-10相比,加入濃度為1 ng/ml的IL-10,細菌聚集成團,BF形成能力增加;IL-10濃度為10 ng/ml時,細菌大量聚集,產(chǎn)生非常明顯的胞外基質(zhì),且形成的BF非常致密,半定量顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);SEM觀察發(fā)現(xiàn),IL-10濃度為10 ng/ml時,細菌

10、緊密排列,形成厚膜狀物,產(chǎn)生大量胞外基質(zhì)。而當濃度為100 ng/ml時,細菌聚集受到抑制,呈零散狀分布于視野中,不形成或較少形成BF,半定量顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同濃度的IL-10對攜帶pRST98的鼠傷寒沙門菌BF形成的影響均強于未攜帶該質(zhì)粒的菌株。④熒光素酶報告基因lux對細菌生長及BF形成的影響:S.typhimuriumχ3337、χ3337/pRST98與帶有l(wèi)ux基因的生物發(fā)光菌χ3337lux、χ33

11、37lux/pRST98細菌生長曲線無差異;結(jié)晶紫染色半定量法分析結(jié)果表明,在96孔板內(nèi)30℃培養(yǎng)3 d的S.typhimuriumχ3337/pRST98與χ3337lux/pRST98,χ3337與χ3337lux兩兩之間OD570差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。⑤IVIS觀察發(fā)光菌在小鼠體內(nèi)的播散:結(jié)果顯示,經(jīng)由尾靜脈感染細菌的荷瘤小鼠在感染后第3 d發(fā)光菌聚集于荷瘤小鼠腫瘤部位,χ3337lux/pRST98發(fā)光強度明顯高于χ

12、3337lux。⑥腫瘤表面BF形成差異:SEM結(jié)果顯示,χ3337lux/pRST98感染組的荷瘤小鼠,χ3337lux/pRST98聚集于腫瘤表面,產(chǎn)生胞外物質(zhì),而χ3337lux感染組細菌呈零散分布。⑦臟器形態(tài)學變化及活菌數(shù):兩感染組的荷瘤小鼠均出現(xiàn)肝臟和脾臟腫大,且表面有點狀病灶,S.typhimuriumχ3337lux/pRST98感染組的臟器腫大和表面充血更嚴重。CFU計數(shù)表明,χ3337lux/pRST98感染組腫瘤、肝臟

13、和脾臟的活菌數(shù)明顯高于χ3337lux感染組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在兩感染組中,腫瘤的活菌數(shù)明顯高于肝臟和脾臟。⑧IL-10表達差異:隨感染時間延長,IL-10表達逐漸增加,且χ3337lux/pRST98組IL-10表達量明顯高于χ3337lux組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：⑴傷寒沙門菌接合性質(zhì)粒pRST98在鼠傷寒沙門菌和大腸埃希菌中均能促進細菌BF形成,但在不同宿主菌中存在異質(zhì)性,即在鼠傷寒