表葡菌生物膜形成相關遺傳背景與表現(xiàn)型關系及抗生素對生物膜形成相關基因影響的研究.pdf

1、目的：了解臨床分離表皮葡萄球菌生物膜形成相關的atlE、foe和ica基因的分布及與生物膜形成表現(xiàn)型之間的關系，了解涉及調(diào)控生物膜形成的基因與生物膜形成、致病力之間的關系和規(guī)律。為探討控制由生物膜形成引起的耐藥難題提供實驗依據(jù)。 方法：收集四川大學華西醫(yī)院臨床微生物室2004年5月至11月從臨床送檢標本中分離得到的非重復不同來源表皮葡萄球菌50株，通過剛果紅試驗和96孔平底組織培養(yǎng)盤半定量實驗檢測其粘附和生物膜形成能力。并分別提

2、取細菌DNA，以種特異性管家基因16S基因為陽性對照，通過PCR擴增目的基因特異片斷，瓊脂糖凝膠電泳后，記錄擴增結(jié)果，檢測目的基因分布情況。統(tǒng)計分析生物膜形成能力與臨床來源及相關基因分布的關系。 結(jié)果：atlE和foe基因臨床分布較廣，分別占58％和80％，其在生物膜表現(xiàn)陰陽性之間差異無統(tǒng)計學意義，說明臨床形成生物膜與它們存在并不是完全相關。icaABD基因占全部臨床分離株的36％，其攜帶與生物膜表現(xiàn)型顯著相關。攜帶全部三種基因

3、16株，其中8株生物膜陽性，經(jīng)檢驗相關顯著。臨床分離導管來源表葡菌與血液及組織感染菌株間生物膜形成能力無顯著差異。 結(jié)論：雖然已有實驗證明atlE和fbe介導表葡菌生物膜形成時的初期粘附，但并非與臨床生物膜形成必然關聯(lián)。Ica基因與臨床生物膜形成顯著相關，單獨攜帶ica基因或共同攜帶3種基因形成生物膜的可能性明顯增加。說明表葡菌生物膜形成時的初期粘附除與atlE和fbe介導有關外，可能還存在其它環(huán)境或遺傳調(diào)控因素。 目的

4、：探索agr系統(tǒng)在MIC抗生素作用下在表皮葡萄球菌生物膜形成、脫離過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化，從而了解抗生素在治療生物膜感染時，本身是否影響了agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平，從而通過agr系統(tǒng)介導了表皮葡萄球菌生物膜耐藥和持續(xù)感染，呈現(xiàn)一種新的耐藥和持續(xù)感染機制。為進一步解決生物膜引起的臨床問題提供理論依據(jù)。 方法：通過對倍稀釋法測定去甲萬古霉素、利福平、阿齊霉素和苯唑西林的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrat

5、ion,MIC)。以靜止期游離表葡菌株為對照，以gDNA為內(nèi)標，采用SYBR實時熒光定量RT-PCR 方法檢測MIC濃度的上述4種抗生素作用下從粘附開始30分鐘、1、2、24、72小時agr系統(tǒng)的hld(RNAⅢ)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，并和無抗生素作用生物膜形成過程相應不同時段agr系統(tǒng)hld(RNAⅢ)基因轉(zhuǎn)錄水平作比較，從而了解抗生素對agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄的影響和是否有通過這種機制耐藥的情況。 結(jié)果：與靜止期游離菌相比，在無抗生素

6、干預時，表葡菌在粘附開始后，hld(RNAⅢ)的轉(zhuǎn)錄水平很快下降，從30分鐘差異即開始明顯，并在隨后數(shù)小時繼續(xù)下降至一個較低水平， 24小時又有一個緩慢的上升趨勢，到72小時時與2小時比較差異有統(tǒng)計學意義。四種抗生素作用下生物膜形成hld(RNAⅢ)的轉(zhuǎn)錄水平經(jīng)相關性分析顯著相關，與游離菌及與無抗生素作用時配對t檢驗差異顯著。在4種抗生素作用下，hld(RNAIII)的轉(zhuǎn)錄水平亦從粘附開始即出現(xiàn)下降趨勢，生物膜形成初期與中后成熟期差異顯

7、著。與無抗生素作用生物膜不同，24及72小時無明顯上升趨勢。4種抗生素作用下，以利福平對hld(RNAIII)的轉(zhuǎn)錄的影響最大，與其它3種抗生素比較有顯著區(qū)別，而其它3種抗生素作用之間經(jīng)配對t檢驗無顯著差異。 結(jié)論：表葡菌生物膜形成過程中，agr系統(tǒng)在初期轉(zhuǎn)錄開始下降，可能通過減少其對atlE和fbe表達的負調(diào)控而使粘附作用增強，生物膜形成后，無抗生素等抑制情況下，agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄又上調(diào)，可能通過表達包含δ-毒素的酚溶解調(diào)理素的

8、去垢劑樣作用介導輸水通道基質(zhì)解離和細菌脫離。在抗生素作用下，生物膜中agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄更為降低，在初期可能加強粘附，但這一作用可能會被其對游離菌的有效抑制而抵消。生物膜形成后期由抗生素抑制的低轉(zhuǎn)錄表達可能更有意義，推測可能會通過減少表達包含δ-毒素的酚溶解調(diào)理素的去垢劑樣作用，導致輸水通道關閉和中斷基質(zhì)解離和細菌脫離，防止細菌脫離后被殺滅，從而反過來顯示對抗生素耐藥。除通過密度感應外，利福平還可能通過了其它環(huán)節(jié)抑制了agr系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄。這可能是