纖維連接蛋白增強肌源性干細胞粘附力的實驗研究.pdf

1、目的： 組織工程陰莖海綿體的構建為陰莖缺損的修復提供了新的選擇?？煽康姆N子細胞、支架及種子細胞與支架的粘附是組織工程主要內(nèi)容，本實驗以preplate技術分離昆明小鼠肌源性干細胞，并鑒定其細胞表型，為組織工程種子細胞提供又一選擇，同時以新西蘭白兔肌源性干細胞為種子細胞，兔脫細胞陰莖海綿體為支架，探索促進二者粘附的因素，以纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)為重點。 材料與方法： 1.實驗動物： 昆

2、明小鼠，1周齡；新西蘭大白兔，雌雄不限，體重1.5～2.0Kg，月齡1～1.5個月。 2.實驗試劑與器材： X Ⅰ型膠原酶；馬血清(HS)、DMEM-LG、Trypsin；dispase：胎牛血清；氨水；Triton-X100：DMSO；MTT；牛血清白蛋白(BSA)；顯微外科手術器械、紫外分光光度計、流式細胞儀等。 3.昆明小鼠肌源性干細胞的分離與鑒定利用Preplate技術分離MDSC：無菌條件下取得昆明小鼠

3、雙后肢肌肉并剪成肉泥，依次使用Ⅺ型膠原酶、dispase及胰酶對組織進行消化，得到的細胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，此為PP1；細胞培養(yǎng)箱中孵育2小時后將PP1中的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP2；隨后每24小時將懸液轉(zhuǎn)移至膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP3～PP6。收集PP6細胞，利用流式細胞儀(FCM)檢測其desmin、CD45及Bcl-2陽性細胞的百分數(shù)；利用免疫細胞化學檢測desmin、Bcl-2表達。 4.新西蘭兔MDSC的

4、分離培養(yǎng)及脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)的制備： 利用Preplate技術分離MDSC，利用流式細胞儀(FCM)檢測其desmin、CD45及Bcl-2陽性細胞的百分數(shù)，符合MDSC表型，培養(yǎng)作為種子細胞。取健康成年雄性新西蘭兔完整陰莖海綿體組織，以Triton-X 100與NH3·H2O混合液進行萃取脫細胞處理。處理后脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)質(zhì)地柔軟，標本作病理組織HE染色，鏡下可見主要成份為膠原及彈性纖維，且排列規(guī)則，未見細胞成份。利用本

5、實驗室已成功的技術流程分離培養(yǎng)MDSC及制備脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)。 5.Fn影響MDSC與脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)粘附的實驗研究： ①取3塊96孔板分為3組：Fn、BSA及未包被組，前兩種蛋白分別包被孔底，未包被組為對照。分4個時點，間隔1h，每孔接種肌源性干細胞5×104個，MTT檢測；②無菌條件下將脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)片(約0.5cm2大小)置入12孔板中心，分別予Fn、BSA包被，未包被作為對照組。接種細胞懸液，每片接

6、種細胞數(shù)為1×105個，培養(yǎng)第3天取基質(zhì)片進行細胞計數(shù)和MTT檢測。 實驗結果： Preplate技術分離的細胞中PP1和PP2貼壁細胞相對較少，PP3開始即有大量的短梭形、圓形或多角形細胞貼壁，這些小體積細胞數(shù)量到PP6時增至80％。它們極易融合，生長呈方向性。流式細胞儀檢測結果顯示PP6細胞的desmin、CD45以及Bcl-2的陽性率平均為82.6％±0.14％、1.03％±0.07％及77.2％±0.11％免疫細

7、胞化學檢測可見較多的desmin及Bcl-2陽性細胞。 脫細胞陰莖海綿體基質(zhì)及分離培養(yǎng)的兔MDSC經(jīng)檢測達到實驗要求，可用于實驗。各組隨著時間的延長，MTT和OD570吸光值增加，組內(nèi)各時點比較有顯著性差異。經(jīng)Fn包被組其MTT和OD570吸光值在各時點均明顯高于預涂BSA組和對照組。BSA組與對照組相比無顯著性差異。脫細胞基質(zhì)進行預處理后再種植肌源性干細胞，經(jīng)Fn預處理組，其細胞計數(shù)、MTT和OD570吸光值明顯高于BSA處理