纖維連接蛋白增強(qiáng)肌源性干細(xì)胞粘附力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 組織工程陰莖海綿體的構(gòu)建為陰莖缺損的修復(fù)提供了新的選擇?？煽康姆N子細(xì)胞、支架及種子細(xì)胞與支架的粘附是組織工程主要內(nèi)容，本實(shí)驗(yàn)以preplate技術(shù)分離昆明小鼠肌源性干細(xì)胞，并鑒定其細(xì)胞表型，為組織工程種子細(xì)胞提供又一選擇，同時(shí)以新西蘭白兔肌源性干細(xì)胞為種子細(xì)胞，兔脫細(xì)胞陰莖海綿體為支架，探索促進(jìn)二者粘附的因素，以纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)為重點(diǎn)。 材料與方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 昆

2、明小鼠，1周齡；新西蘭大白兔，雌雄不限，體重1.5～2.0Kg，月齡1～1.5個(gè)月。 2.實(shí)驗(yàn)試劑與器材： X Ⅰ型膠原酶；馬血清(HS)、DMEM-LG、Trypsin；dispase：胎牛血清；氨水；Triton-X100：DMSO；MTT；牛血清白蛋白(BSA)；顯微外科手術(shù)器械、紫外分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀等。 3.昆明小鼠肌源性干細(xì)胞的分離與鑒定利用Preplate技術(shù)分離MDSC：無(wú)菌條件下取得昆明小鼠

3、雙后肢肌肉并剪成肉泥，依次使用Ⅺ型膠原酶、dispase及胰酶對(duì)組織進(jìn)行消化，得到的細(xì)胞懸液接種入培養(yǎng)瓶，此為PP1；細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后將PP1中的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP2；隨后每24小時(shí)將懸液轉(zhuǎn)移至膠原包被的培養(yǎng)瓶，此為PP3～PP6。收集PP6細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)其desmin、CD45及Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)；利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)desmin、Bcl-2表達(dá)。 4.新西蘭兔MDSC的

4、分離培養(yǎng)及脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)的制備： 利用Preplate技術(shù)分離MDSC，利用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)其desmin、CD45及Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，符合MDSC表型，培養(yǎng)作為種子細(xì)胞。取健康成年雄性新西蘭兔完整陰莖海綿體組織，以Triton-X 100與NH3·H2O混合液進(jìn)行萃取脫細(xì)胞處理。處理后脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)質(zhì)地柔軟，標(biāo)本作病理組織HE染色，鏡下可見(jiàn)主要成份為膠原及彈性纖維，且排列規(guī)則，未見(jiàn)細(xì)胞成份。利用本

5、實(shí)驗(yàn)室已成功的技術(shù)流程分離培養(yǎng)MDSC及制備脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)。 5.Fn影響MDSC與脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)粘附的實(shí)驗(yàn)研究： ①取3塊96孔板分為3組：Fn、BSA及未包被組，前兩種蛋白分別包被孔底，未包被組為對(duì)照。分4個(gè)時(shí)點(diǎn)，間隔1h，每孔接種肌源性干細(xì)胞5×104個(gè)，MTT檢測(cè)；②無(wú)菌條件下將脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)片(約0.5cm2大小)置入12孔板中心，分別予Fn、BSA包被，未包被作為對(duì)照組。接種細(xì)胞懸液，每片接

6、種細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，培養(yǎng)第3天取基質(zhì)片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： Preplate技術(shù)分離的細(xì)胞中PP1和PP2貼壁細(xì)胞相對(duì)較少，PP3開(kāi)始即有大量的短梭形、圓形或多角形細(xì)胞貼壁，這些小體積細(xì)胞數(shù)量到PP6時(shí)增至80％。它們極易融合，生長(zhǎng)呈方向性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示PP6細(xì)胞的desmin、CD45以及Bcl-2的陽(yáng)性率平均為82.6％±0.14％、1.03％±0.07％及77.2％±0.11％免疫細(xì)

7、胞化學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)較多的desmin及Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞。 脫細(xì)胞陰莖海綿體基質(zhì)及分離培養(yǎng)的兔MDSC經(jīng)檢測(cè)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，可用于實(shí)驗(yàn)。各組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MTT和OD570吸光值增加，組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較有顯著性差異。經(jīng)Fn包被組其MTT和OD570吸光值在各時(shí)點(diǎn)均明顯高于預(yù)涂BSA組和對(duì)照組。BSA組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理后再種植肌源性干細(xì)胞，經(jīng)Fn預(yù)處理組，其細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT和OD570吸光值明顯高于BSA處理