肌源性干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及神經(jīng)變性疾病都需要進(jìn)行神經(jīng)功能的恢復(fù)治療。細(xì)胞治療及組織工程的出現(xiàn)為此類患者提供了新的選擇，其中種子細(xì)胞的選擇是一大關(guān)鍵因素。理想的種子細(xì)胞應(yīng)具備來源豐富、易獲取、增殖力強(qiáng)、可多向分化的特點(diǎn)。肌源性干細(xì)胞(Muscle-derived stem cell，MDSC)便是其中一種近年來被發(fā)現(xiàn)并逐漸成為研究熱點(diǎn)的新型種子細(xì)胞。 本課題從新西蘭兔肌肉中分離并純化出：MDSC，將其誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，探索其純化方法及分化

2、特性。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為以下兩個(gè)部分： 1.MDSC的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定 2.MDSC體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞 第一章 兔MDSC的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：2～3周齡新西蘭兔，體重約0.7～1kg；Ⅺ型膠原酶(Sigma)、Dispase(Roche)、Trypsin(Gibco)；小鼠抗Desmin(博士德)、兔抗bcl-2(博士德)；馬血清(HS，Hyclone)、胎牛血清(FBS，四季

3、青)；DMEM-LG；25CM2賴氨酸表面處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶。 方法：采用改進(jìn)的酶消化及Preplating技術(shù)分離MDSC：無菌條件下取新西蘭兔大腿肌肉并剪成肉泥，依次用Ⅺ型膠原酶、Dispase及rrypsin／EDTA進(jìn)行消化，每次消化之間離心并取糊狀上清進(jìn)行下一步消化，最后離心取沉淀，用培養(yǎng)基重懸后接種于經(jīng)賴氨酸表面處理的培養(yǎng)瓶，此為PPl；細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h后將PP1中的懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，此為PP2；之后每隔24h將

4、懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶，此為PP3～PP6。收集PP6細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并于傳代時(shí)應(yīng)用差速貼壁法再次純化，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)確定細(xì)胞表型。 結(jié)果：經(jīng)過連續(xù)6d的差速貼壁分離得到短梭形及小菱形的小體積細(xì)胞，傳代后進(jìn)一步純化。FCM結(jié)果顯示PP6細(xì)胞的desmin、bc1-2及CD45的陽性率分別為97.474-0.22％、96.18+0.1l％及1.19±0.05％。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示大多數(shù)細(xì)胞為desmin及

5、bcl-2陽性。 結(jié)論：采用改進(jìn)的酶消化及Preplating技術(shù)能很好地分離并純化出MDSC。 第二章MDSC體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)試劑及器材：B27、全反式維甲酸(ATRA)、β-巰基乙醇、Neurobasal培養(yǎng)基；小鼠抗Nestin、Cy3-羊抗小鼠IgG；流式細(xì)胞儀、超凈臺(tái)、熒光顯微鏡等。 方法：采用添加誘導(dǎo)劑直接誘導(dǎo)分化的方法：將第3代MDSC接種到六孔板，添加含2.51μM全反式維甲酸

6、，2.5mMβ-巰基乙醇及2％B27的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分兩組觀察：A組3天后換用Neurobasal(含2％B27)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，B組2天后換用Neurobasal(含2％B27)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)誘導(dǎo)共6d的細(xì)胞進(jìn)行FCM及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Nestin的表達(dá)情況。 結(jié)果：誘導(dǎo)處理后的細(xì)胞表達(dá)Nestin，F(xiàn)CM結(jié)果顯示A、B兩組陽性率分別為94.67±2.40％及87.88±5.62％，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)可見很多nestin陽性細(xì)