大腦神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)骨骼肌肌源性干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．探討骨骼肌源性干細(xì)胞體外分離純化、培養(yǎng)、鑒定的方法，研究骨骼肌源性干細(xì)胞的生物學(xué)特性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2．評(píng)估不同濃度的大腦神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在體外誘導(dǎo)骨骼肌肌源性干細(xì)胞后，肌源性干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的能力；并鑒定分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞，為以后的神經(jīng)組織工程提供種子細(xì)胞。 方法： 1．采用Ⅺ型膠原酶和胰蛋白酶二步消化法獲取大鼠骨骼肌肌源性干細(xì)胞，微孔尼龍網(wǎng)純化肌源性干細(xì)胞后進(jìn)行體外

2、原代和傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的形態(tài)，通過生長曲線、細(xì)胞融合率等指標(biāo)研究骨骼肌源性干細(xì)胞的增殖與分化能力，利用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光染色對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 2．體外提取純度較高的肌源性干細(xì)胞后，采用bFGF、EGF誘導(dǎo)肌源性干細(xì)胞成細(xì)胞球樣細(xì)胞團(tuán)，在貼壁的情況下，用不同濃度的大腦神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）誘導(dǎo)分化，并檢測GFAP的表達(dá)。 結(jié)果： 1．二步消化法適用于骨骼肌肌源性干細(xì)胞細(xì)胞的獲取。通過不同直徑的微

3、孔尼龍過濾網(wǎng)（11um，20um，30um，41um）純化骨骼肌肌源性干細(xì)胞。在生長培養(yǎng)基作用下，細(xì)胞增殖旺盛：在分化培養(yǎng)基條件下，細(xì)胞分化良好，可融合成肌管。Desmin和CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性。 2．次代細(xì)胞在肌源性干細(xì)胞生長培養(yǎng)液中大部分貼壁生長，少數(shù)懸浮、成團(tuán)。懸浮細(xì)胞生長較快，7～15 d出現(xiàn)神經(jīng)球樣細(xì)胞團(tuán)，神經(jīng)球轉(zhuǎn)入預(yù)涂有多聚賴氨酸的24孔板后，加入不同濃度的BDNF，細(xì)胞逐漸貼壁生長，呈多種細(xì)胞形態(tài)：兩極長

4、的梭形細(xì)胞；有2～3個(gè)長突起的多角形細(xì)胞；突起多而短的多角形細(xì)胞；不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞再作GFAP免疫組化染色，GFAP（+）。GFAP陽性率隨BDNF濃度的升高而增加。 結(jié)論： 1．體外培養(yǎng)的骨骼肌肌源性干細(xì)胞具有良好的增殖與分化能力，微孔尼龍網(wǎng)過濾可純化骨骼肌肌源性干細(xì)胞。控制血清的濃度，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，骨骼肌肌源性干細(xì)胞適用于組織工程和基因治療。 2．BDNF作用于骨骼肌肌源性干細(xì)胞，可使細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞