肌源性干細胞治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、女性壓力性尿失禁(SUI)是指在腹壓突然增加時出現(xiàn)無法控制的漏尿，SUI是一種婦科常見疾病，隨人口老年化加重，其發(fā)病率越來越高?？啬虻闹鲃訖C制由膀胱頸部、尿道括約肌和尿道肌肉組織的主動收縮完成，這些肌肉的主動收縮產(chǎn)生使膀胱出口關(guān)閉的壓力。導致SUI的關(guān)鍵機制主要有兩種，尿道固有括約肌結(jié)構(gòu)及功能缺陷和膀胱頸支撐功能障礙。其中尿道固有括約肌缺陷(ISD)是導致女性SUI的重要原因，特別是老年女性，幾乎都有括約肌異常的因素。在女性，造成尿道括

2、約肌功能缺陷的最主要原因是年老和產(chǎn)傷，分娩創(chuàng)傷和其他尿失禁的誘發(fā)因素，可使得支配相關(guān)肌肉的神經(jīng)受到損害或肌肉本身損傷，從而使盆底肌和括約肌的質(zhì)量和數(shù)量發(fā)生改變。正常機體局部肌肉組織損傷后會發(fā)生組織再生，由肌肉組織內(nèi)的成肌細胞再生，以修復損傷的肌肉組織，但尿道括約肌的再生能力有限，在ISD患者存在有明顯的成肌功能障礙。 SUI的治療方法眾多，包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療，由于這些方法均僅解決膀胱頸支撐功能障礙，不能糾正ISD，因此長期

3、療效不理想，且并發(fā)癥多。特別是對由于ISD所致的SUI，由于成肌功能障礙的存在，傳統(tǒng)的治療方法療效更差，從本質(zhì)上改善ISD的治療方法是糾正其成肌功能障礙，即恢復ISD所致SUI患者成肌細胞作用或功能。最直接的方法就是采用成肌干細胞移植進行細胞治療。 細胞治療的目的是旨在利用多潛能干細胞的再生能力和可塑性以恢復丟失或患病的組織，替代、修復或增強受損組織或器官的生物學功能。由于肌肉干細胞來源容易，以肌肉干細胞為基礎(chǔ)的治療研究得到廣泛

4、開展，包括骨骼肌損傷、心肌和平滑肌損傷等，已有成功用于臨床的研究報道。目前一些研究報道骨骼肌成肌細胞尿道內(nèi)注射移植后能在尿道括約肌長期存活并可改善尿控功能。但是成肌細胞移植存在許多問題，包括移植后細胞存活率低下以及增殖能力不強，這些均限制了衛(wèi)星細胞移植治療的應用。MDSCs是肌肉內(nèi)高度未分化的多潛能干細胞，具有增殖快、融合慢、多分化潛能等特性，移植后存活率高等特點，是一種理想的細胞移植物。 由于MDSCs數(shù)量極少，因此MDSCs

5、的分離和體外培養(yǎng)是MDSCs移植的關(guān)鍵，目前尚無MDSCs體外培養(yǎng)研究報道。MDSCs在體外和體內(nèi)均具有多分化潛能，其分化和生存均受微環(huán)境的影響，實驗所采用的動物、模型的建立方法以及細胞的注射時機等均影響移植MDSCs的存活和分化。但目前尚無MDSCs移植至接近人SUI病理生理狀態(tài)模型的研究報道。 本研究在體外通過改良差速貼壁技術(shù)分離MDSCs，在MDSCs上轉(zhuǎn)染pEGFP-N1作標記，將MDSC移植至SUI大鼠的近端尿道，檢測

6、了MDSCs移植后體內(nèi)形態(tài)和分布以及尿動力學變化，為壓力性尿失禁干細胞移植治療提供理論基礎(chǔ)。主要實驗方法及研究結(jié)果如下： 一、MDSCs分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染： 1、本研究采用改良差速貼壁技術(shù)，對既往報道的分離技術(shù)進行了改進：1、取新生大鼠肌肉標本分離細胞。2、減少貼壁次數(shù)。發(fā)現(xiàn)，將6步貼壁減少至5步，而維持總的貼壁時間不變，分離得到的細胞數(shù)量相對增加，細胞為小圓形，結(jié)蛋白染色陽性，與6步貼壁法分離得到MDSCs一致，提示分離

7、得到的細胞為MDSCs。采用5步貼壁分離技術(shù)有以下優(yōu)點：(1)、簡化了實驗步驟。(2)、增加了MDSCs的量。 2、MDSCs培養(yǎng)：本課題發(fā)現(xiàn)，MDSCs原代培養(yǎng)48小時后開始增殖，在原代培養(yǎng)6～8天后細胞數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)較多的長梭形細胞，提示出現(xiàn)成纖維細胞混雜。傳代后成纖維細胞的數(shù)量明顯減少，但在傳代細胞培養(yǎng)4～5天后，培養(yǎng)的細胞中又出現(xiàn)成纖維細胞，并逐漸增多。在傳代細胞培養(yǎng)的第6～7天采用消化法對MDSCs進行純化，可顯著

8、減少成纖維細胞。 3、MDSCs結(jié)蛋白染色：取第三代細胞行結(jié)蛋白免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下見MDSCs的胞漿表達有綠色熒光。 二、壓力性尿失禁模型建立和MDSC移植治療 1、壓力性尿失禁模型建立：本研究通過雙側(cè)坐骨神經(jīng)橫斷術(shù)建立SUI模型，發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)橫斷后2周，LPP顯著下降，提示尿道固有括約肌尿控功能下降，尿道組織學檢查示尿道周圍肌肉有萎縮，所建立的模型同時有尿道括約肌結(jié)構(gòu)和功能缺陷，類似于人ISD。

9、 2、MDSCs移植治療：通過在MDSCs上轉(zhuǎn)染pEGFP-N1作標記，系統(tǒng)檢測了MDSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠近端尿道周圍后細胞的分化和分布，通過測定漏尿點壓力檢測了MDSCs移植后尿控功能變化。發(fā)現(xiàn)，MDSCs移植后第7天和第14天，LPP均得到顯著提高，提示尿道括約肌功能得到改善。但MDSCs移植不能完全恢復LPP，說明MDSCs移植不能完全恢復ISD。在移植后第一天和第三天，MDSCs保持小圓形和橢圓形，局限于注射部位。

10、移植后第七天，一部分強熒光細胞呈長梭形，熒光細胞的分布較前擴大，但局限于尿道周圍肌肉內(nèi)，提示移植后第7天一部分MDSCs開始分化，并在尿道周圍發(fā)生了有限的遷移。移植后第10天，部分強熒光細胞呈長梭形，一部分失去正常細胞形態(tài)，提示移植的MDSCs部分分化為肌細胞，部分死亡。在移植后第14天，熒光細胞中部分呈長梭形，未見圓形細胞，提示除已分化成肌纖維的MDSCs外，其余MDSCs變性。結(jié)果提示MDSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠后能存活、分

11、化而整合至宿主尿道括約肌，改善壓力性尿失禁大鼠的尿控功能。 總之，通過改良差速貼壁技術(shù)可成功從新生大鼠分離MDSCs。在MDSCs體外培養(yǎng)時有成纖維分化趨勢，采用消化法傳代并在培養(yǎng)過程中采用消化法純化可以減少成纖維細胞，提高MDSCs的純度。將轉(zhuǎn)染有pEGFP-N1的MDSCs移植至SUI大鼠近端尿道后，漏尿點壓力得到顯著提高，尿道括約肌的尿控功能得到明顯改善。移植的MDSCs存活并分化而整合至尿道括約肌，本研究為MDSCs移植