可注射性纖維蛋白膠聯(lián)合肌源干細(xì)胞移植治療女性壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討可注射性纖維蛋白膠聯(lián)合大鼠肌源干細(xì)胞移植對(duì)女性壓力性尿失禁大鼠模型的作用及機(jī)制，為細(xì)胞治療女性壓力性尿失禁提供新的思路。
　　 方法：⑴采用改良差速貼壁法培養(yǎng)大鼠MDSCs，分別采用流氏細(xì)胞儀技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)P3-MDSCs進(jìn)行表型鑒定，對(duì)分化培養(yǎng)傳3代的MDSCs檢測(cè)MyHC蛋白表達(dá)。⑵于6孔板中分別進(jìn)行膠中立體培養(yǎng)及膠表面培養(yǎng)P3-MDSCs(1×105/ml)，掃描電鏡下觀察接種第1、7

2、天細(xì)胞形態(tài)；于96孔板中分別進(jìn)行三組P3-MDSCs培養(yǎng)(5×103/孔)：膠中培養(yǎng)組(A)、膠表面培養(yǎng)組(B)、孔板表面培養(yǎng)組(C)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。⑶以最適MOI值的攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒感染P1-MDSCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染效率，并傳代備用。采用雙側(cè)陰部神經(jīng)切除建立雌性大鼠壓力性尿失禁模型，75只成年雌性大鼠隨機(jī)均分為五組：聯(lián)合注射組(FM)及單細(xì)胞注射組(M)以1×106個(gè)細(xì)胞

3、/只的細(xì)胞數(shù)注入尿道距膀胱約0.5cm處，并設(shè)纖維蛋白膠注射組(F)、溶劑對(duì)照組(D)、假手術(shù)組(S)為不同對(duì)照組；每組再按注射后1周、2周、4周分為3個(gè)亞組(每組5只)，采用多重免疫熒光染色技術(shù)及激光共聚焦掃描顯微鏡評(píng)價(jià)移植細(xì)胞存活及分化；尿動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)注射后1、2、4周尿道閉合功能；熒光定量PCR法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)注射后1、2、4周近端尿道組織胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)；并評(píng)價(jià)注射后4

4、周近端尿道毛細(xì)血管生成；伊紅-蘇木素(HE)及Masson染色評(píng)價(jià)注射后4周近端尿道組織病理學(xué)。
　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的大鼠MDSCs分離后72小時(shí)貼壁，14～16天70％融合可傳代；傳1、3代的細(xì)胞增殖較快，傳7代的細(xì)胞增殖減慢。細(xì)胞鑒定結(jié)果：CD34弱陽性(21.15％)、CD45陰性(0.85％)、Sca-1為強(qiáng)陽性、Desmin高表達(dá)；分化培養(yǎng)傳3代的MDSCs，肌管MyHC呈強(qiáng)陽性表達(dá)。②在膠中培養(yǎng)(A組)的細(xì)胞呈緩

5、慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，滯留期約為4天，第8天逐漸進(jìn)入平臺(tái)期；膠表面培養(yǎng)(B組)及培養(yǎng)板表面培養(yǎng)(C組)細(xì)胞生長(zhǎng)滯留期約為3天，第7天進(jìn)入平臺(tái)期。A組細(xì)胞倍增時(shí)間長(zhǎng)于B、C組但無明顯差別(P＞0.05)，B組與C組細(xì)胞倍增時(shí)間相近(P＞0.05)。③以最適MOI為20的GFP慢病毒感染P1-MDSCs并傳代至P3時(shí)GFP陽性細(xì)胞均達(dá)91.74％以上。在體內(nèi)，注射后1周，聯(lián)合注射組存活細(xì)胞的數(shù)量較單細(xì)胞注射組明顯增多(P＜0.05)，注射后4周，兩組

6、均可見MDSCs融合于宿主肌層，均可見肌管分化，聯(lián)合注射組MyHC陽性表達(dá)多于單細(xì)胞注射組。不同時(shí)間點(diǎn)腹壓漏尿點(diǎn)壓力及最大膀胱容量聯(lián)合注射組及單細(xì)胞注射組較溶劑對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，聯(lián)合注射組略高于單細(xì)胞注射組但無差別。聯(lián)合注射組近端尿道IGF-1、VEGF表達(dá)1、2周明顯上調(diào)，與溶劑對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01)，而單細(xì)胞注射組僅于移植后1周高于溶劑對(duì)照組(P＜0.05)。聯(lián)合注射組于注射后1周VEGF表達(dá)高于單細(xì)胞注

7、射組(P＜0.05)；注射后4周，聯(lián)合注射組近端尿道毛細(xì)血管密度明顯增加，高于其余各組(P＜0.01)；聯(lián)合注射組肌肉/膠原比率低于假手術(shù)組(P＜0.01)，明顯高于其余各組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：利用改良差速貼壁法培養(yǎng)大鼠MDSCs簡(jiǎn)便易行、純度高；纖維蛋白膠與體外培養(yǎng)的大鼠MDSCs具有良好的生物相容性；纖維蛋白膠作為組織工程支架可促進(jìn)移植細(xì)胞的早期存活、分化，促進(jìn)模型大鼠近端尿道IGF-1、VEGF表達(dá)，增加新生血