人胚胎干細(xì)胞基因修飾誘導(dǎo)免疫耐受的初步研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)能在體外培養(yǎng)條件下無(wú)限增殖并分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞，因而被認(rèn)為可能成為細(xì)胞/組織/器官移植的重要供體來(lái)源。此外，人胚胎干細(xì)胞同時(shí)也是研究人胚胎發(fā)育學(xué)的理想模型，較成體干細(xì)胞有更廣闊的應(yīng)用前景。目前大多數(shù)的hESCs是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MouSe Embryonic Fibroblast，MEF)上建系的。然而出于將來(lái)臨床應(yīng)用的需要，有必要去除動(dòng)物源性物質(zhì)的

2、影響。因此科學(xué)家們進(jìn)一步發(fā)展了人源飼養(yǎng)層或無(wú)飼養(yǎng)層的培養(yǎng)方法。但是，雖然對(duì)hESCs自我更新和分化機(jī)制的研究已經(jīng)獲得重要進(jìn)展，但是在hESCs的臨床應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)前仍然有許多障礙： 1)hESCs擴(kuò)增效率有待提高。與小鼠胚胎干細(xì)胞相比，hESCs增殖速度較慢，單細(xì)胞克隆性增殖的效率也較低，大約為1﹪。hESCs增殖速度慢則難于獲得足夠的細(xì)胞用于研究和臨床應(yīng)用，而較低的單細(xì)胞克隆性增殖的效率則使hESCs的基因修飾的應(yīng)用尤為困難。 2)與其

3、他細(xì)胞系和小鼠胚胎干細(xì)胞(MouseEmbryonic Stem Cells，mESCs)相比，轉(zhuǎn)基因操作并達(dá)到在hESCs穩(wěn)定基因修飾的工具是有限的，而基因修飾是細(xì)胞替代治療所必需的。3)hESCs的移植與其它器官、組織或細(xì)胞移植技術(shù)一樣存在hESCs與受者M(jìn)HC匹配的要求，hESCs及其產(chǎn)物的替代治療不可避免地面臨移植免疫排斥問(wèn)題。 前兩者是相關(guān)的。為了篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的hESCs，除了發(fā)展能高效進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的工具，改善

4、hESCs的培養(yǎng)條件提高h(yuǎn)ESCs克隆化生長(zhǎng)效率從而有利于篩選低效率的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的hESCs尤為重要。高效進(jìn)行轉(zhuǎn)基因是研究hESCs的重要工具，也是誘導(dǎo)hESCs的免疫耐受、解決免疫排斥問(wèn)題的重要途徑之經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路被認(rèn)為與胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖、腫瘤或創(chuàng)傷后的組織再生以及其他很多生物過(guò)程有關(guān)，更被認(rèn)為與干細(xì)胞的自我更新和分化有關(guān)。因此研究Wnt在hESCs增殖與分化方面的作用值得進(jìn)一步探索。 T細(xì)胞活化是T細(xì)胞受體(T-

5、cell Receptor，TCR)與抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell，APC)的主要組織相容性抗原(madior histologiccomplexity，MHC)結(jié)合(信號(hào)1)和T細(xì)胞CD28與APC細(xì)胞的B7結(jié)合(信號(hào)2)共同作用的結(jié)果，缺乏信號(hào)2的共刺激信號(hào)可以引起T細(xì)胞的凋亡、無(wú)反應(yīng)等從而引起免疫耐受。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)分子4(cytotoxic Tlymphocyte-associated m

6、olecule-4，CTLA4)也與B7結(jié)合，但起抑制信號(hào)作用。吲哚胺-2，3雙氧化酶 (indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)是色氨酸(Tryptophan)代謝通路的限速酶，而色氨酸是T細(xì)胞的必需氨基酸，色氨酸的不足同樣可以引起T細(xì)胞的凋亡、無(wú)反應(yīng)等從而引起免疫耐受。CTLA4和IDO誘導(dǎo)免疫耐受的作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面已經(jīng)得到了證實(shí)，CTLA4與B7的結(jié)合還能促進(jìn)APC細(xì)胞IDO的表達(dá)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)分子

7、4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 immunoglobin，CTLA4Ig)是融合蛋白，能阻斷CD28和B7的結(jié)合。CTLA4Ig、IDO非常適合作為誘導(dǎo)免疫耐受的靶基因。 為了研究免疫排斥/耐受必須進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，因而需要發(fā)展敏感而又非侵入性的工具以監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞(比如hESCs及其分化產(chǎn)物)的動(dòng)向。在過(guò)去的幾年中已經(jīng)發(fā)展了多種非侵入性的影像學(xué)技術(shù)

8、。與其他的影像學(xué)技術(shù)如以HSV-tk為基礎(chǔ)的影像學(xué)技術(shù)相比，熒光素酶為基礎(chǔ)的影像學(xué)技術(shù)最具吸引力，因?yàn)樗欠欠派湫缘模掖嬖诒容^少的與酶相關(guān)的免疫問(wèn)題。 目的： 1)研究Wnt/catenin通路在hESCs自我更新和增殖中的作用，改善hESCs人源飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，以提高h(yuǎn)ESCs的擴(kuò)增效率和克隆化生長(zhǎng)的效率。 2)研究慢病毒載體對(duì)hESCs進(jìn)行基因修飾的效率，觀察慢病毒載體對(duì)hESCs多能性的影響。

9、3)發(fā)展無(wú)侵入的體內(nèi)監(jiān)測(cè)小鼠hESCs及其分化產(chǎn)物異種移植免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影像學(xué)方法。 4)研究在免疫完全小鼠進(jìn)行hESCs及其分化產(chǎn)物移植中CTLA-4 Ig和IDO誘導(dǎo)免疫耐受的可能。 方法： 1)應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，研究Wnt蛋白在hESCs自我更新和分化方面的作用。在永生化的人源飼養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt基因和三種抗生素抗性基因(Hygromycin，neomycin和puromycin)，即W3R細(xì)胞

10、系。檢測(cè)W3R支持未分化狀態(tài)hESCs培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后穩(wěn)定整合目的基因的hESCs克隆可能。 2)用常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建能表達(dá)目的基因和藥物抗性基因的慢病毒載體。測(cè)定其滴度并應(yīng)用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)hESCs。利用W3R飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行篩選后，檢測(cè)穩(wěn)定整合目的基因的hESCs表達(dá)未分化標(biāo)記物和它們向三個(gè)胚層分化的能力； 3)轉(zhuǎn)導(dǎo)熒光素酶基因以利于細(xì)胞移植到活體后的影像學(xué)檢查。通過(guò)系列稀釋hESCs檢測(cè)Xenogen檢測(cè)系統(tǒng)的

11、敏感性。移植到小鼠宿主體內(nèi)后，仍然用相同的Xenogen檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)所移植細(xì)胞的存在與增殖。 4)雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)熒光素酶基因和CTLA4-Ig或IDO基因的hESCs移植于Balb/c來(lái)源的Rag<'-/->γ<'-/->小鼠做為陽(yáng)性對(duì)照。Xenogen檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)兩組中移植細(xì)胞免疫排斥/耐受的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。 結(jié)果： 1)Wnt蛋白能刺激hESCs的分化，在CM或bFGF存在的條件下則刺激增殖。同時(shí)通過(guò)基因修飾在永生化的

12、人成纖維細(xì)胞過(guò)量表達(dá)Wnt蛋白和三種抗性基因，成功篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染外源基因的hESCs。 2)應(yīng)用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)hESCs，能同時(shí)表達(dá)目的基因和藥物抗性基因，能檢測(cè)到目的基因的體外功能和蛋白表達(dá)。 3)兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hESCs仍然保持未分化狀態(tài)和向三個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力，細(xì)胞形態(tài)、克隆大小和外觀以及生長(zhǎng)速度等都沒(méi)有明顯變化。 4)體外Xenogen檢測(cè)系統(tǒng)的熒光素信號(hào)敏感性是20，000hESCs細(xì)胞。 5)

13、單純過(guò)量表達(dá)CTLA4Ig或IDO的hESCs移植Balb/C小鼠經(jīng)過(guò)7天信號(hào)消失，經(jīng)過(guò)4周的觀察仍未見熒光素信號(hào)重新出現(xiàn)。 結(jié)論： 1)在沒(méi)有條件培養(yǎng)基或bFGF的條件下Wnt蛋白能促進(jìn)分化，在添加這些組份后Wnt蛋白能促進(jìn)hESCs的自我更新。 2)W3R飼養(yǎng)細(xì)胞能夠支持未分化hESCs的生長(zhǎng)并促進(jìn)克隆形成。這一培養(yǎng)系統(tǒng)可用于篩選轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hESCs3)慢病毒載體可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)hESCs。利用兩個(gè)啟動(dòng)子或I

14、RES系統(tǒng)，用一個(gè)載體可以表達(dá)兩種轉(zhuǎn)基因。 4)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hESCs可維持未分化狀態(tài)并表達(dá)多能性標(biāo)記物Oct-4 TRA-1-60、形成類胚胎體、分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞。 5)通過(guò)在hESCs過(guò)量表達(dá)熒光素酶能實(shí)現(xiàn)非侵入性的活體影像學(xué)檢查。hESCs細(xì)胞熒光素信號(hào)體外Xenogen檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性是20，000細(xì)胞。 6)轉(zhuǎn)導(dǎo)CTLA4-Ig或IDO的hESCs與對(duì)照組細(xì)胞(transduced iDuet)在Rag