人胚胎干細胞基因修飾誘導免疫耐受的初步研究.pdf

1、人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖并分化為三個胚層的細胞，因而被認為可能成為細胞/組織/器官移植的重要供體來源。此外，人胚胎干細胞同時也是研究人胚胎發(fā)育學的理想模型，較成體干細胞有更廣闊的應用前景。目前大多數(shù)的hESCs是在小鼠胚胎成纖維細胞(MouSe Embryonic Fibroblast，MEF)上建系的。然而出于將來臨床應用的需要，有必要去除動物源性物質(zhì)的

2、影響。因此科學家們進一步發(fā)展了人源飼養(yǎng)層或無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)方法。但是，雖然對hESCs自我更新和分化機制的研究已經(jīng)獲得重要進展，但是在hESCs的臨床應用成為現(xiàn)實前仍然有許多障礙： 1)hESCs擴增效率有待提高。與小鼠胚胎干細胞相比，hESCs增殖速度較慢，單細胞克隆性增殖的效率也較低，大約為1﹪。hESCs增殖速度慢則難于獲得足夠的細胞用于研究和臨床應用，而較低的單細胞克隆性增殖的效率則使hESCs的基因修飾的應用尤為困難。 2)與其

3、他細胞系和小鼠胚胎干細胞(MouseEmbryonic Stem Cells，mESCs)相比，轉(zhuǎn)基因操作并達到在hESCs穩(wěn)定基因修飾的工具是有限的，而基因修飾是細胞替代治療所必需的。3)hESCs的移植與其它器官、組織或細胞移植技術(shù)一樣存在hESCs與受者MHC匹配的要求，hESCs及其產(chǎn)物的替代治療不可避免地面臨移植免疫排斥問題。 前兩者是相關的。為了篩選出穩(wěn)定表達外源基因的hESCs，除了發(fā)展能高效進行轉(zhuǎn)基因的工具，改善

4、hESCs的培養(yǎng)條件提高hESCs克隆化生長效率從而有利于篩選低效率的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因的hESCs尤為重要。高效進行轉(zhuǎn)基因是研究hESCs的重要工具，也是誘導hESCs的免疫耐受、解決免疫排斥問題的重要途徑之經(jīng)典的Wnt信號通路被認為與胚胎發(fā)育過程中細胞增殖、腫瘤或創(chuàng)傷后的組織再生以及其他很多生物過程有關，更被認為與干細胞的自我更新和分化有關。因此研究Wnt在hESCs增殖與分化方面的作用值得進一步探索。 T細胞活化是T細胞受體(T-

5、cell Receptor，TCR)與抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cell，APC)的主要組織相容性抗原(madior histologiccomplexity，MHC)結(jié)合(信號1)和T細胞CD28與APC細胞的B7結(jié)合(信號2)共同作用的結(jié)果，缺乏信號2的共刺激信號可以引起T細胞的凋亡、無反應等從而引起免疫耐受。細胞毒性T淋巴細胞相關分子4(cytotoxic Tlymphocyte-associated m

6、olecule-4，CTLA4)也與B7結(jié)合，但起抑制信號作用。吲哚胺-2，3雙氧化酶 (indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)是色氨酸(Tryptophan)代謝通路的限速酶，而色氨酸是T細胞的必需氨基酸，色氨酸的不足同樣可以引起T細胞的凋亡、無反應等從而引起免疫耐受。CTLA4和IDO誘導免疫耐受的作用在動物實驗方面已經(jīng)得到了證實，CTLA4與B7的結(jié)合還能促進APC細胞IDO的表達。細胞毒性T細胞相關分子

7、4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4 immunoglobin，CTLA4Ig)是融合蛋白，能阻斷CD28和B7的結(jié)合。CTLA4Ig、IDO非常適合作為誘導免疫耐受的靶基因。 為了研究免疫排斥/耐受必須進行體內(nèi)實驗和動物模型實驗，因而需要發(fā)展敏感而又非侵入性的工具以監(jiān)測移植細胞(比如hESCs及其分化產(chǎn)物)的動向。在過去的幾年中已經(jīng)發(fā)展了多種非侵入性的影像學技術(shù)

8、。與其他的影像學技術(shù)如以HSV-tk為基礎的影像學技術(shù)相比，熒光素酶為基礎的影像學技術(shù)最具吸引力，因為它是非放射性的，而且存在比較少的與酶相關的免疫問題。 目的： 1)研究Wnt/catenin通路在hESCs自我更新和增殖中的作用，改善hESCs人源飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系，以提高hESCs的擴增效率和克隆化生長的效率。 2)研究慢病毒載體對hESCs進行基因修飾的效率，觀察慢病毒載體對hESCs多能性的影響。

9、3)發(fā)展無侵入的體內(nèi)監(jiān)測小鼠hESCs及其分化產(chǎn)物異種移植免疫反應動力學的影像學方法。 4)研究在免疫完全小鼠進行hESCs及其分化產(chǎn)物移植中CTLA-4 Ig和IDO誘導免疫耐受的可能。 方法： 1)應用細胞培養(yǎng)和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的方法，研究Wnt蛋白在hESCs自我更新和分化方面的作用。在永生化的人源飼養(yǎng)層細胞轉(zhuǎn)導Wnt基因和三種抗生素抗性基因(Hygromycin，neomycin和puromycin)，即W3R細胞

10、系。檢測W3R支持未分化狀態(tài)hESCs培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導后穩(wěn)定整合目的基因的hESCs克隆可能。 2)用常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建能表達目的基因和藥物抗性基因的慢病毒載體。測定其滴度并應用慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導hESCs。利用W3R飼養(yǎng)細胞進行篩選后，檢測穩(wěn)定整合目的基因的hESCs表達未分化標記物和它們向三個胚層分化的能力； 3)轉(zhuǎn)導熒光素酶基因以利于細胞移植到活體后的影像學檢查。通過系列稀釋hESCs檢測Xenogen檢測系統(tǒng)的

11、敏感性。移植到小鼠宿主體內(nèi)后，仍然用相同的Xenogen檢測系統(tǒng)監(jiān)測所移植細胞的存在與增殖。 4)雙重轉(zhuǎn)導熒光素酶基因和CTLA4-Ig或IDO基因的hESCs移植于Balb/c來源的Rag<'-/->γ<'-/->小鼠做為陽性對照。Xenogen檢測系統(tǒng)監(jiān)測兩組中移植細胞免疫排斥/耐受的細胞動力學。 結(jié)果： 1)Wnt蛋白能刺激hESCs的分化，在CM或bFGF存在的條件下則刺激增殖。同時通過基因修飾在永生化的

12、人成纖維細胞過量表達Wnt蛋白和三種抗性基因，成功篩選轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染外源基因的hESCs。 2)應用慢病毒載體轉(zhuǎn)導hESCs，能同時表達目的基因和藥物抗性基因，能檢測到目的基因的體外功能和蛋白表達。 3)兩次轉(zhuǎn)導后的hESCs仍然保持未分化狀態(tài)和向三個胚層細胞分化的能力，細胞形態(tài)、克隆大小和外觀以及生長速度等都沒有明顯變化。 4)體外Xenogen檢測系統(tǒng)的熒光素信號敏感性是20，000hESCs細胞。 5)

13、單純過量表達CTLA4Ig或IDO的hESCs移植Balb/C小鼠經(jīng)過7天信號消失，經(jīng)過4周的觀察仍未見熒光素信號重新出現(xiàn)。 結(jié)論： 1)在沒有條件培養(yǎng)基或bFGF的條件下Wnt蛋白能促進分化，在添加這些組份后Wnt蛋白能促進hESCs的自我更新。 2)W3R飼養(yǎng)細胞能夠支持未分化hESCs的生長并促進克隆形成。這一培養(yǎng)系統(tǒng)可用于篩選轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導后的hESCs3)慢病毒載體可以高效轉(zhuǎn)導hESCs。利用兩個啟動子或I

14、RES系統(tǒng)，用一個載體可以表達兩種轉(zhuǎn)基因。 4)轉(zhuǎn)導后的hESCs可維持未分化狀態(tài)并表達多能性標記物Oct-4 TRA-1-60、形成類胚胎體、分化為三個胚層的細胞。 5)通過在hESCs過量表達熒光素酶能實現(xiàn)非侵入性的活體影像學檢查。hESCs細胞熒光素信號體外Xenogen檢測系統(tǒng)的敏感性是20，000細胞。 6)轉(zhuǎn)導CTLA4-Ig或IDO的hESCs與對照組細胞(transduced iDuet)在Rag