ILT基因修飾的樹突狀細胞誘導移植物免疫耐受的研究.pdf

1、目前異基因造血干細胞移植(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation，Allo-HSCT)是根治多種惡性血液病的唯一手段。但移植后的并發(fā)癥，尤其是移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease，GVHD)仍然是影響移植療效的重要因素，是目前移植領域亟待解決的課題。GVHD是由供者移植物中的T淋巴細胞識別宿主主要和次要組織相容性抗原引起的免疫反應。這些抗原由抗原

2、遞呈細胞(APC)呈遞后，通過MHC-Ⅰ、Ⅱ分子結(jié)合于供者T細胞，從而激活T細胞，發(fā)生GVHD。在防治移植排斥的研究和臨床實踐中，強有力的免疫抑制劑及去除供者移植物中T淋巴細胞的策略最常采用。但是，大量免疫抑制劑的使用，除本身諸如肝腎毒性等毒副作用外，隨用藥時間的延長，免疫抑制劑所引起的嚴重的機會感染等矛盾日益突出。同樣去除移植物中的T細胞雖然可以顯著降低GVHD的發(fā)生率并可減輕其嚴重程度，但是移植物中由于缺乏T細胞，其增強免疫和移植物

3、抗白血病(GVL)作用也顯著降低。統(tǒng)計結(jié)果表明，用去除供者T細胞的骨髓移植治療白血病，病人的復發(fā)率明顯升高。實際上在移植物中導致GVHD發(fā)生的T細胞僅僅是T細胞中很少的一部分，是針對主要及次要組織相容性抗原特異性的Th1細胞，而與GVL相關的是Th2細胞。所以，最理想的方法是能夠選擇性地清除引起GVHD的淋巴細胞，同時保留具有GVL作用和其它功能的細胞。 樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)是體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞

4、(AntigenPresenting Cell，APC)，其免疫學功能具有兩重性。在一定條件下，能處理提呈抗原，表達共刺激分子，分泌細胞因子，活化T淋巴細胞，產(chǎn)生免疫應答，但在另一些條件下卻可使T細胞產(chǎn)生耐受，即介導免疫耐受。近來有應用腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將具有誘導耐受作用的免疫抑制分子靶基因轉(zhuǎn)染給供體DC并使其表達。已不斷有實驗證實，單獨轉(zhuǎn)導以上各靶基因可降低移植物排斥機率，延長器官植活時間。 免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物(Imm

5、unoglobulin-like Transcript，ILT)3和ILT4是表達于DC表面的抑制性受體，對于耐受性DC的形成起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3或細胞因子(如IL-10，IFN-α等)能誘導未成熟DC轉(zhuǎn)化為耐受性DC，而IL-10還可使ILT4表達增高，同時下調(diào)共刺激信號分子CD86等的表達。這些都說明ILT3、ILT4表達增加可能是耐受性DC的共同特征，高表達或強制性表達的ILT3、ILT4可誘導DC耐受，從而使

6、機體產(chǎn)生免疫耐受。 基于以上的研究，我們認為用ILT基因轉(zhuǎn)染DC后，體外與供體造血干細胞移植物混合培養(yǎng)，有望能選擇性清除引起GVHD反應的T淋巴細胞，而同時保留抗腫瘤、抗感染的淋巴細胞。 第一部分：首先從大鼠骨髓中分離并誘導擴增DC進行功能鑒定，將重組腺病毒載體構建ILT轉(zhuǎn)染DC并進一步檢測轉(zhuǎn)染后Dc生物學特性，觀察ILT基因轉(zhuǎn)染對Dc的影響。 結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染后RT-PCR檢測高表達ILT，表明腺病毒載體能有效的

7、將ILT轉(zhuǎn)染DC上；用流式細胞術對基因轉(zhuǎn)染前后Dc細胞表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ等表型進行分析，沒有發(fā)現(xiàn)明顯改變，這些說明ILT基因轉(zhuǎn)染后沒有改變DC原有的活性和基本功能，作為本目的基因的表達載體具有可使用性。 第二部分：探討ILT-DC對異基因T細胞的作用。通過MTT法檢測異基因混合淋巴細胞增殖情況表明，經(jīng)過ILT-DC與無病毒轉(zhuǎn)染DC(對照組)相比顯著抑制了淋巴細胞增殖。進一步用Annexin V/PI雙檢法檢測I