ILT基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)移植物免疫耐受的研究.pdf

1、目前異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation，Allo-HSCT)是根治多種惡性血液病的唯一手段。但移植后的并發(fā)癥，尤其是移植物抗宿主病(Graft Versus Host Disease，GVHD)仍然是影響移植療效的重要因素，是目前移植領(lǐng)域亟待解決的課題。GVHD是由供者移植物中的T淋巴細(xì)胞識(shí)別宿主主要和次要組織相容性抗原引起的免疫反應(yīng)。這些抗原由抗原

2、遞呈細(xì)胞(APC)呈遞后，通過MHC-Ⅰ、Ⅱ分子結(jié)合于供者T細(xì)胞，從而激活T細(xì)胞，發(fā)生GVHD。在防治移植排斥的研究和臨床實(shí)踐中，強(qiáng)有力的免疫抑制劑及去除供者移植物中T淋巴細(xì)胞的策略最常采用。但是，大量免疫抑制劑的使用，除本身諸如肝腎毒性等毒副作用外，隨用藥時(shí)間的延長，免疫抑制劑所引起的嚴(yán)重的機(jī)會(huì)感染等矛盾日益突出。同樣去除移植物中的T細(xì)胞雖然可以顯著降低GVHD的發(fā)生率并可減輕其嚴(yán)重程度，但是移植物中由于缺乏T細(xì)胞，其增強(qiáng)免疫和移植物

3、抗白血病(GVL)作用也顯著降低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，用去除供者T細(xì)胞的骨髓移植治療白血病，病人的復(fù)發(fā)率明顯升高。實(shí)際上在移植物中導(dǎo)致GVHD發(fā)生的T細(xì)胞僅僅是T細(xì)胞中很少的一部分，是針對主要及次要組織相容性抗原特異性的Th1細(xì)胞，而與GVL相關(guān)的是Th2細(xì)胞。所以，最理想的方法是能夠選擇性地清除引起GVHD的淋巴細(xì)胞，同時(shí)保留具有GVL作用和其它功能的細(xì)胞。 樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞

4、(AntigenPresenting Cell，APC)，其免疫學(xué)功能具有兩重性。在一定條件下，能處理提呈抗原，表達(dá)共刺激分子，分泌細(xì)胞因子，活化T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但在另一些條件下卻可使T細(xì)胞產(chǎn)生耐受，即介導(dǎo)免疫耐受。近來有應(yīng)用腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將具有誘導(dǎo)耐受作用的免疫抑制分子靶基因轉(zhuǎn)染給供體DC并使其表達(dá)。已不斷有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單獨(dú)轉(zhuǎn)導(dǎo)以上各靶基因可降低移植物排斥機(jī)率，延長器官植活時(shí)間。 免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物(Imm

5、unoglobulin-like Transcript，ILT)3和ILT4是表達(dá)于DC表面的抑制性受體，對于耐受性DC的形成起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，維生素D3或細(xì)胞因子(如IL-10，IFN-α等)能誘導(dǎo)未成熟DC轉(zhuǎn)化為耐受性DC，而IL-10還可使ILT4表達(dá)增高，同時(shí)下調(diào)共刺激信號(hào)分子CD86等的表達(dá)。這些都說明ILT3、ILT4表達(dá)增加可能是耐受性DC的共同特征，高表達(dá)或強(qiáng)制性表達(dá)的ILT3、ILT4可誘導(dǎo)DC耐受，從而使

6、機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。 基于以上的研究，我們認(rèn)為用ILT基因轉(zhuǎn)染DC后，體外與供體造血干細(xì)胞移植物混合培養(yǎng)，有望能選擇性清除引起GVHD反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，而同時(shí)保留抗腫瘤、抗感染的淋巴細(xì)胞。 第一部分：首先從大鼠骨髓中分離并誘導(dǎo)擴(kuò)增DC進(jìn)行功能鑒定，將重組腺病毒載體構(gòu)建ILT轉(zhuǎn)染DC并進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染后Dc生物學(xué)特性，觀察ILT基因轉(zhuǎn)染對Dc的影響。 結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染后RT-PCR檢測高表達(dá)ILT，表明腺病毒載體能有效的

7、將ILT轉(zhuǎn)染DC上；用流式細(xì)胞術(shù)對基因轉(zhuǎn)染前后Dc細(xì)胞表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ等表型進(jìn)行分析，沒有發(fā)現(xiàn)明顯改變，這些說明ILT基因轉(zhuǎn)染后沒有改變DC原有的活性和基本功能，作為本目的基因的表達(dá)載體具有可使用性。 第二部分：探討ILT-DC對異基因T細(xì)胞的作用。通過MTT法檢測異基因混合淋巴細(xì)胞增殖情況表明，經(jīng)過ILT-DC與無病毒轉(zhuǎn)染DC(對照組)相比顯著抑制了淋巴細(xì)胞增殖。進(jìn)一步用Annexin V/PI雙檢法檢測I