羊棲菜多糖誘導人大腸癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景羊棲菜是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。早在我國《神農本草經》中，羊棲菜的藥用功能就有所記載，而現代醫(yī)學研究也表明，羊棲菜及其提取物中有多種抗腫瘤和改善人體免疫的活性成分。鑒于近年來我國結腸癌的高發(fā)生率和可行抗腫瘤療法的效果不甚理想，該疾病的預防和治療成為公共健康的首要任務，積極開發(fā)研制新藥是當務之急，而中藥因為毒副作用低等特點引起了人們的廣泛關注。 近年來，關于羊棲菜水提物的抗腫瘤作用的研究已

2、有報道，并證實具有一定的抑瘤作用。羊棲菜多糖(Sargassumfusiformepolysaccharides，SFPS)作為羊棲菜水提物的主要成分，主要含有褐藻酸、羊棲菜多糖硫酸酯(FCD)、褐藻淀粉，其分子量在3500-10000之間，在生物體細胞膜間的穿透能力強。作為一種海藻多糖，具有調節(jié)免疫功能，提高細胞免疫力，促進淋巴細胞的轉化，在體內間接激活巨噬細胞的吞噬功能，具有抗腫瘤作用，抗感染作用以及降血脂等作用。以往對SFPS的研

3、究多以動物作為研究對象，圍繞其免疫促進功能和對荷瘤動物體內自由基、脂質過氧化的影響展開的。對于體外誘導人大腸癌細胞凋亡及其相關分子機制的研究，迄今鮮見報道。該研究對于開發(fā)有價值的抗腫瘤天然藥物，貢獻于人類的衛(wèi)生健康事業(yè)具有重要的意義。 研究目的本實驗選擇人大腸癌細胞系lovo細胞和RKO細胞，作為羊棲菜多糖(SFPS)抗腫瘤的研究對象，從分子水平深入探討SFPS誘導lovo細胞和RKO細胞凋亡及其分子機制，為開發(fā)傳統(tǒng)中藥羊棲菜提

4、供理論基礎。研究方法(1)MTT法觀察SFPS體外抑制lovo細胞和RKO細胞的增殖作用； (2)DNA提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAladder；(3)掃描電鏡、透射電鏡觀察lovo細胞和RKO細胞形態(tài)學變化；(4)膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/PI檢測lovo細胞和RKO細胞凋亡率；(5)PI單染檢測lovo細胞和RKO細胞的周期變化；(6)Western印跡檢測caspase-3、caspase-8、caspas

5、e-9的活化片斷；(7)RT-PCR檢測caspase-3mRNA的表達；(8)Caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性檢測。研究結果MTT結果發(fā)現，SFPS對lovo細胞和RKO細胞具有顯著的生長抑制作用，并在一定范圍內呈量效關系。瓊脂糖凝膠電泳顯示，300mg/LSFPS作用24h后，lovo和RKO細胞均產生典型的DNAladder，呈180-200bp整數倍遞增，lovo細胞的DNAladder比RKO細

6、胞清晰；隨著藥物濃度高達1000mg/L時，兩種細胞產生的DNAladder模糊，開始出現“涂片狀”(smear)。細胞形態(tài)學觀察發(fā)現，經300mg/LSFPS處理72h后，lovo和RKO細胞微絨毛減少、染色質固縮、邊集，形成“帽狀”或“新月狀”等一系列典型凋亡形態(tài)。 流式細胞術結果均顯示，在一定濃度范圍內，SFPS誘導細胞凋亡的作用呈現濃度和時間依賴性，并與腫瘤細胞增殖抑制作用相一致。同時SFPS對RKO細胞作用后，G0/G

7、1期的細胞比例有不同程度的增高，相應的S期細胞比例顯著下降。而藥物作用后的lovo細胞的細胞周期時相比例無明顯改變。 在對caspase活性檢測中，我們發(fā)現兩種細胞caspase-3酶原蛋白表達均降低，caspase-3mRNA高表達，并具有劑量和時間的依賴性。而caspase-3，8，9活性檢測發(fā)現，在藥物處理后的RKO細胞中caspase-8，9均被激活進而形成具有活性的片段，caspase-3的活性則伴隨著caspase-

8、8和caspase-9的活性升高而逐步增強。然而在lovo細胞中，僅有caspase-9被激活，caspase-3隨著caspase-9的活性增強而升高，其中caspase-8的活性無顯著變化。 研究結論(1)SFPS是一種有效的抗腫瘤藥物，其抑制腫瘤增殖與誘導細胞凋亡有關。SFPS對RKO細胞的抗腫瘤作用還和G0/G1期細胞阻滯有關，對lovo細胞的抗腫瘤作用與細胞周期無關。(2)SFPS對同一種細胞的抗腫瘤效果和其作用濃度、