羊棲菜多糖誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景羊棲菜是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，具有較高的營養(yǎng)和藥用價值。早在我國《神農(nóng)本草經(jīng)》中，羊棲菜的藥用功能就有所記載，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明，羊棲菜及其提取物中有多種抗腫瘤和改善人體免疫的活性成分。鑒于近年來我國結(jié)腸癌的高發(fā)生率和可行抗腫瘤療法的效果不甚理想，該疾病的預(yù)防和治療成為公共健康的首要任務(wù)，積極開發(fā)研制新藥是當(dāng)務(wù)之急，而中藥因為毒副作用低等特點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注。 近年來，關(guān)于羊棲菜水提物的抗腫瘤作用的研究已

2、有報道，并證實具有一定的抑瘤作用。羊棲菜多糖(Sargassumfusiformepolysaccharides，SFPS)作為羊棲菜水提物的主要成分，主要含有褐藻酸、羊棲菜多糖硫酸酯(FCD)、褐藻淀粉，其分子量在3500-10000之間，在生物體細(xì)胞膜間的穿透能力強(qiáng)。作為一種海藻多糖，具有調(diào)節(jié)免疫功能，提高細(xì)胞免疫力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)間接激活巨噬細(xì)胞的吞噬功能，具有抗腫瘤作用，抗感染作用以及降血脂等作用。以往對SFPS的研

3、究多以動物作為研究對象，圍繞其免疫促進(jìn)功能和對荷瘤動物體內(nèi)自由基、脂質(zhì)過氧化的影響展開的。對于體外誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)分子機(jī)制的研究，迄今鮮見報道。該研究對于開發(fā)有價值的抗腫瘤天然藥物，貢獻(xiàn)于人類的衛(wèi)生健康事業(yè)具有重要的意義。 研究目的本實驗選擇人大腸癌細(xì)胞系lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞，作為羊棲菜多糖(SFPS)抗腫瘤的研究對象，從分子水平深入探討SFPS誘導(dǎo)lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制，為開發(fā)傳統(tǒng)中藥羊棲菜提

4、供理論基礎(chǔ)。研究方法(1)MTT法觀察SFPS體外抑制lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞的增殖作用； (2)DNA提取和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAladder；(3)掃描電鏡、透射電鏡觀察lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；(4)膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/PI檢測lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞凋亡率；(5)PI單染檢測lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞的周期變化；(6)Western印跡檢測caspase-3、caspase-8、caspas

5、e-9的活化片斷；(7)RT-PCR檢測caspase-3mRNA的表達(dá)；(8)Caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性檢測。研究結(jié)果MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFPS對lovo細(xì)胞和RKO細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用，并在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。瓊脂糖凝膠電泳顯示，300mg/LSFPS作用24h后，lovo和RKO細(xì)胞均產(chǎn)生典型的DNAladder，呈180-200bp整數(shù)倍遞增，lovo細(xì)胞的DNAladder比RKO細(xì)

6、胞清晰；隨著藥物濃度高達(dá)1000mg/L時，兩種細(xì)胞產(chǎn)生的DNAladder模糊，開始出現(xiàn)“涂片狀”(smear)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)300mg/LSFPS處理72h后，lovo和RKO細(xì)胞微絨毛減少、染色質(zhì)固縮、邊集，形成“帽狀”或“新月狀”等一系列典型凋亡形態(tài)。 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，SFPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)濃度和時間依賴性，并與腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用相一致。同時SFPS對RKO細(xì)胞作用后，G0/G

7、1期的細(xì)胞比例有不同程度的增高，相應(yīng)的S期細(xì)胞比例顯著下降。而藥物作用后的lovo細(xì)胞的細(xì)胞周期時相比例無明顯改變。 在對caspase活性檢測中，我們發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞caspase-3酶原蛋白表達(dá)均降低，caspase-3mRNA高表達(dá)，并具有劑量和時間的依賴性。而caspase-3，8，9活性檢測發(fā)現(xiàn)，在藥物處理后的RKO細(xì)胞中caspase-8，9均被激活進(jìn)而形成具有活性的片段，caspase-3的活性則伴隨著caspase-

8、8和caspase-9的活性升高而逐步增強(qiáng)。然而在lovo細(xì)胞中，僅有caspase-9被激活，caspase-3隨著caspase-9的活性增強(qiáng)而升高，其中caspase-8的活性無顯著變化。 研究結(jié)論(1)SFPS是一種有效的抗腫瘤藥物，其抑制腫瘤增殖與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。SFPS對RKO細(xì)胞的抗腫瘤作用還和G0/G1期細(xì)胞阻滯有關(guān)，對lovo細(xì)胞的抗腫瘤作用與細(xì)胞周期無關(guān)。(2)SFPS對同一種細(xì)胞的抗腫瘤效果和其作用濃度、