瘦素與大腸癌細(xì)胞HCT-116增殖及凋亡的研究.pdf

1、大腸癌的發(fā)病與生活方式、飲食習(xí)慣密切相關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查顯示，大腸癌的發(fā)病與能量攝入過多、肥胖、運(yùn)動(dòng)減少等因素有關(guān)。在發(fā)展中國家，飲食“西方化”，體力活動(dòng)的減少導(dǎo)致的肥胖是大腸癌發(fā)病率快速上升的重要原因。據(jù)預(yù)測，我國的大腸癌發(fā)病率和死亡率在今后相當(dāng)長時(shí)間將逐步上升，那么大腸癌將成為最常見的惡性腫瘤之一。瘦素是肥胖基因編碼的多肽類激素，主要由脂肪組織分泌，調(diào)節(jié)脂肪代謝和能量平衡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，瘦素和諸多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究

2、首先檢測了瘦素及其受體在大腸癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步研究瘦素對大腸癌細(xì)胞株HCT-116增殖和凋亡的影響及探討其可能的作用機(jī)制，為瘦素在大腸癌中的作用及其機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　第一章瘦素及其受體在大腸癌組織中的表達(dá)
　　目的: 檢測不同臨床分期的大腸癌組織中瘦素及其受體的表達(dá)情況，揭示瘦素及其受體與大腸癌不同臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法: 收集大腸癌病理標(biāo)本108例，用免疫組織化學(xué)法檢測瘦素及其受體在大

3、腸癌組織中表達(dá)的部位，并對其表達(dá)強(qiáng)弱進(jìn)行分級。同時(shí)，檢測各病理標(biāo)本中p-Akt、p-GSK3、p-mTOR、p-P70S6K的表達(dá)，分析瘦素及其受體的表達(dá)與p-Akt、p-GSK3、p-mTOR、p-P70S6K之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果: 瘦素及其受體在大腸癌組織中表達(dá)陽性為細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色顆粒。瘦素在正常腸黏膜組織、腺瘤性息肉和大腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為10％、27.5％、71.3％，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);

4、瘦素受體在正常腸黏膜組織、腺瘤性息肉、大腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為0％、20％、52.8％，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。瘦素、瘦素受體的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瘦素的表達(dá)不僅與大腸癌的浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度呈明顯的相關(guān)性(p＜0.01)，而且與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)分子p-Akt、p-GSK3、 p-mTOR、p-P70S6K分子的表達(dá)呈明顯的相關(guān)性(p＜0.0

5、1)，而與患者的年齡和性別無相關(guān)性(p＞0.05)。提示瘦素可能是一種與大腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)的實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)，拮抗瘦素或其受體可能作為臨床治療大腸癌的一種輔助手段。
　　結(jié)論: 大腸癌組織中存在較高表達(dá)的瘦素及其受體;瘦素及其受體的表達(dá)和大腸癌的浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度有明顯相關(guān)性。
　　第二章瘦素對大腸癌細(xì)胞HCT-116增殖及凋亡的影響
　　目的: 從正反兩方面檢測瘦素對大腸癌細(xì)胞HCT-1

6、16增殖及凋亡的作用，并探討其可能的機(jī)制，為大腸癌的治療提供新的方法和理論依據(jù)。
　　方法: 常規(guī)培養(yǎng)HCT-116大腸癌細(xì)胞，用RT-PCR和Western blot法分別檢測ObRa、ObRb的表達(dá)情況。分別用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度瘦素（0 ng/mL、10ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）的作用下大腸癌細(xì)胞HCT-116的增殖情況;用流

7、式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度瘦素作用下，大腸癌細(xì)胞HCT-116的凋亡情況。同時(shí)，為了進(jìn)一步確定瘦素促進(jìn)大腸癌細(xì)胞系HCT-116的增殖，抑制其凋亡的分子機(jī)制，我們檢測了瘦素刺激下不同時(shí)間點(diǎn)PI3K/Akt/ mTOR信號通路中的關(guān)鍵分子p-Akt、p-GSK3、p-mTOR、p-P70S6K的變化;分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)法，分別用PI3K和mTOR分子抑制劑LY294002和rapamycin對PI3K/Akt/mTOR信號通路中的分子

8、進(jìn)行阻斷，檢測其對HCT-116細(xì)胞增殖與凋亡的影響。并通過RT-PCR方法對不同劑量的瘦素作用不同時(shí)間對HCT-116細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因的影響。
　　結(jié)果: 通過檢測大腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞系中瘦素受體ObRa和ObRb的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HCT-116細(xì)胞系高表達(dá)瘦素受體ObRa和ObRb。在不同濃度的瘦素刺激HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞的存活比值明顯比無瘦素刺激的大腸癌細(xì)胞要高，而當(dāng)瘦素濃度為50 ng/mL、100ng/

9、mL、200 ng/mL組時(shí)，與無瘦素刺激組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明在100 ng/mL，200 ng/mL瘦素刺激后，HCT-116細(xì)胞的克隆形成率明顯增多，與無瘦素刺激的HCT-116細(xì)胞的克隆形成率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);在200 ng/mL瘦素刺激下，細(xì)胞形成的軟瓊脂集落數(shù)為39.5±3個(gè)，集落形成率為3.95％，而無瘦素刺激培養(yǎng)的細(xì)胞形成的軟瓊脂集落數(shù)為22±2個(gè)，集落形

10、成率為2.2％;流式細(xì)胞術(shù)表明，瘦素能明顯抑制無血清培養(yǎng)的大腸癌細(xì)胞HCT-116的凋亡。100 ng/mL的瘦素作用30 min時(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)分子p-Akt、p-GSK3、p-mTOR、p-P70S6K活化最強(qiáng)，因此我們分別利用PI3K和mTOR分子抑制劑LY294002和rapamycin對PI3K/Akt/mTOR信號通路中的分子進(jìn)行阻斷，發(fā)現(xiàn)LY294002和rapamycin均能抑制瘦素誘導(dǎo)的HCT

11、-116細(xì)胞的增殖，抑制HCT-116細(xì)胞的凋亡。瘦素促進(jìn)增殖、凋亡相關(guān)基因Survivin、Mcl-1、A1、NF-κB的表達(dá)呈時(shí)間依賴性，隨著瘦素刺激的時(shí)間的延長，上述相關(guān)基因的表達(dá)逐漸增加;用不同濃度的瘦素刺激大腸癌細(xì)胞48 h，瘦素促進(jìn)增殖、凋亡相關(guān)基因Survivin、Mcl-1、A1、NF-κB的表達(dá)呈劑量依賴性，隨著瘦素刺激劑量的增加，上述相關(guān)基因的表達(dá)逐漸增加。
　　結(jié)論: 瘦素能夠促進(jìn)人大腸癌細(xì)胞系HCT-116