急性髓系白血病T淋巴細胞亞型、相關細胞因子和轉錄因子分析及其與臨床關聯(lián)研究.pdf

1、目的：
　　檢測急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者T淋巴細胞亞型CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD4/CD8、NK細胞等比例，評估AML患者在不同病程階段的細胞免疫功能差異；檢測 AML患者、正常對照及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血漿白細胞介素（interleukin，IL）-12、干擾素（interferon，IFN）-γ和IL-

2、10表達水平，以及外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中轉錄因子T-box expressed in T cells（T-bet）、GATA binding protein3（GATA3）和Forkhead/winged helix transcription factor（FoxP3）基因mRNA表達水平；結合臨床資料，分析IL-12、IFN-γ、IL-10及相關轉錄因子（T

3、-bet、GATA3和 FoxP3）表達水平與 AML的臨床特征及預后的關系；并探討重組人白細胞介素2（recombinant human interleukin-2，rhIl-2）和重組人腫瘤壞死因子（recombinant human tumor-α，rhTNF-α）刺激對AML患者IL-12、IFN-γ、IL-10及相關轉錄因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表達水平的影響。從而為進一步揭示AML的發(fā)病機制，探索新的治療策略

4、提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　研究一：AML患者T淋巴細胞亞型的檢測和臨床意義分析
　　收集58例AML患者，65例對照組外周血，采用雙色或三色直接免疫熒光素法標記細胞抗原，包括細胞膜表面和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD127、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）及效應性T細胞（effector T cell，Teff）等，多參數(shù)流式細胞術檢測T淋巴細胞亞型；
　　研究二：IL-

5、12、IFN-γ、IL-10及轉錄因子（T-bet、GATA3及 FoxP3）在 AML患者中的表達及臨床關聯(lián)研究
　　收集30例AML患者、63例正常對照和27例SLE患者外周血樣本，提取血漿及PBMC，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血漿IL-12、IFN-γ和IL-10的表達水平；通過實時定量PCR法（quantitative real-time po

6、lymerase chain reaction，qRT-PCR）測定PBMC中轉錄因子（T-bet、GATA3和FoxP3）表達水平；
　　研究三：IL-2和TNF-α對AML患者PBMC刺激的效應研究
　　收集30例AML患者外周血樣本，提取PBMC。使用rhIL-2和rhTNF-α刺激PBMC后，采用ELISA測定上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平，通過qRT-PCR測定PBMC中T-bet、GATA3和Fo

7、xP3的mRNA表達水平。
　　結果：
　　研究一：AML患者T淋巴細胞亞型的檢測和臨床意義分析
　　（1）全部AML初診患者與正常對照、緩解組及復發(fā)組T淋巴細胞亞型檢測結果比較：四組間CD3+T細胞、CD4+T細胞、Treg細胞、CD4/CD8及Treg/Teff細胞比例差異有統(tǒng)計學意義（均有P<0.05）；進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)：初診AML組CD3+T細胞比例低于正常對照、緩解組及復發(fā)組（均有 P<0.05）；初診組

8、CD4+T細胞比例分別低于對照組及緩解組；緩解組CD4/CD8比值高于正常對照組及復發(fā)組（均有 P<0.05）；復發(fā)組 Treg細胞比例高于初診、緩解及正常對照組（均有P<0.05）；繼發(fā)AML組NK細胞比例分別低于原發(fā) AML組及正常對照組（均有P<0.05）；緩解AML組Treg/Teff比值大于正常對照組、AML復發(fā)及初診組，復發(fā)AML組比值高于正常對照組（均有P<0.05）。
　?。?）AML初診患者中，原發(fā)AML與繼發(fā)A

9、ML患者T淋巴細胞亞型檢測結果比較：原發(fā)AML患者CD4+T比例、Treg/Teff比例均高于繼發(fā)AML患者（均有P<0.05），CD8+T細胞比例均低于繼發(fā) AML患者和正常對照（均有 P<0.05），而CD4/CD8比值則高于正常對照組和繼發(fā)AML組（均有P<0.05）。繼發(fā)AML患者CD4+T細胞比例、CD4/CD8比值均低于正常對照（均有P<0.05），而CD8+T細胞比例高于正常（P<0.05）。
　　研究二：相關細胞因

10、子（IL-12、IFN-γ、IL-10）和轉錄因子（T-bet、GATA3、FoxP3）在AML患者中的表達及臨床關聯(lián)研究
　?。?）AML、SLE和正常對照血漿IL-12、IFN-γ及IL-10表達水平的比較：AML組IL-12、IFN-γ及IL-10表達水平均最低，SLE組IL-12、IFN-γ及IL-10表達水平均最高，三組間差異有統(tǒng)計學意義（均有P<0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AML組IL-12表達水平均低于正常對照組和SL

11、E組（均有P<0.05）；AML組IFN-γ表達水平低于SLE組（P=0.002），SLE組IFN-γ表達水平高于正常對照組（P=0.003）；AML組IL-10表達水平低于正常對照組和SLE組（P=0.002；P<0.001）；SLE組IL-10表達水平高于正常對照組（P=0.040）。
　?。?）IL-10、IL-12與IFN-γ作為AML患者診斷指標的ROC曲線分析：IL-12與IFN-γ的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學意義（P

12、=0.781），IL-12與IL-10的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學意義（P=0.637），IL-10與IFN-γ的ROC曲線面積差異無統(tǒng)計學意義（P=0.885）。
　　（3）AML患者、SLE患者與正常對照PBMC中T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表達水平比較：AML組T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA的表達水平均最低，SLE組最高，三組間差異均有統(tǒng)計學意義（均有P<0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，AML患者

13、組T-bet基因mRNA的表達水平低于對照組和SLE組（均有P<0.05）；SLE組T-bet基因mRNA的表達水平高于對照組（P<0.001）；AML組FoxP3基因mRNA的表達水平低于SLE組（P<0.001），SLE組FoxP3基因mRNA的表達水平高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；AML組GATA3基因mRNA的表達水平均低于對照組和SLE組（均有P<0.05）。
　　組（均有P<0.05），SLE組

14、T-bet/GATA3的水平高于正常對照組（P<0.001）。
　?。?）AML患者血漿IL-10、IL-12和PBMC中IFN-γ，T-bet、FoxP3和GATA3基因mRNA表達與主要臨床特征的關系：除初診白細胞>100×109/L患者的GATA3基因mRNA水平低于初診白細胞<100×109患者外（P=0.040），其余各組的IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3和GATA3間差異均無統(tǒng)計學意義（均有P

15、>0.05）。
　　乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）與細胞因子及轉錄因子之間的相關性分析：LDH與IL-10、IL-12呈正相關，相關系數(shù)rs分別為0.642（P=0.002）和0.662（P=0.001），與GATA3呈負相關（rs=-0.580, P=0.007）。
　?。?）AML、SLE患者IL-10、IL-12、IFN-γ、T-bet、FoxP3、GATA3的相關性分析：AML患者中

16、 IFN-γ與 IL-10、IL-12呈正相關，相關系數(shù) rs分別為0.766（P<0.001）和0.608（P<0.001）；IL-10與 IL-12呈正相關，相關系數(shù) rs為0.719（P<0.001）；T-bet與FoxP3之間呈正相關，相關系數(shù)rs為0.383（P=0.037）。SLE患者：IFN-γ與IL-10、IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相關，相關系數(shù)rs分別為0.473（P=0.013）、0.608（P=0.0

17、01）、0.408（P=0.035）和0.432（P=0.024）；IL-10與IL-12、T-bet和FoxP3均呈正相關，相關系數(shù)rs為0.444（P=0.020）、0.399（P=0.039）和0.488（P=0.010）；T-bet與 FoxP3、GATA3之間均呈正相關，相關系數(shù) rs分別為0.383（P=0.037）、0.722（P<0.001）和0.529（P<0.001）。
　　研究三：IL-2、TNF-α對AML

18、患者PBMC刺激的效應研究
　?。?）rhIL-2、rhTNF-α體外刺激對AML患者PBMC上清液中IL-12、IFN-γ和IL-10水平的影響：應用3種濃度的rhIL-2刺激后，IL-12、IFN-γ、IL-10表達均無顯著改變（均有P>0.05）；3種濃度的rhTNF-α刺激，IL-12、IFN-γ、IL-10表達均無顯著改變（均有P>0.05）。
　?。?）rhIL-2、rhTNF-?體外刺激對 AML患者 PBMC

19、中 T-bet、FoxP3和GATA3mRNA水平的影響：rhIL-2刺激后，GATA3的mRNA表達無顯著改變（P=0.326）；T-bet的mRNA表達有顯著變化（P<0.001）；FoxP3的mRNA表達有顯著變化（P=0.003）。
　　rhTNF-α刺激后，GATA3和 FoxP3的 mRNA表達均未發(fā)生顯著改變（均有P>0.05）；但T-bet的mRNA表達有顯著變化（P<0.001）。
　　結論：
　　初

20、診AML組免疫平衡向抑制性傾斜，繼發(fā)AML組機體的免疫功能進一步受到抑制，進而出現(xiàn)CD4/CD8明顯倒置，提示繼發(fā)AML患者免疫功能受損更為嚴重。復發(fā)AML組Treg細胞比例高于初診AML組、AML緩解組和正常對照組。AML患者血漿IL-12和IL-10及PBMC相關轉錄因子（T-bet、GATA3及FoxP3）表達水平均低于正常對照組和SLE組，表明AML患者體內(nèi)出現(xiàn)了免疫抑制現(xiàn)象。同時發(fā)現(xiàn)rhIL-2的刺激可上調(diào)AML患者PBMC中