多囊卵巢綜合征瘦素抵抗的分子機(jī)理研究.pdf

1、目的:對(duì)多囊卵巢綜合征(Polycysticovarysyndrome，PCOS)患者瘦素水平的變化及其相關(guān)因素進(jìn)行分析，探討血清性激素、胰島素抵抗(Insulinresistance，IR)與瘦素抵抗(Leptinresistance，LR)的關(guān)系；研究PCOS患者卵泡液瘦素水平變化及與卵細(xì)胞受精率、卵裂率的關(guān)系；探討瘦素對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞雌激素(E2)和孕激素(P)分泌的體外影響；研究瘦素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子JAK2(janusk

2、inases2)和STAT-3(signaltransducersandactivatorsoftranscription)在PCOS的瘦素抵抗發(fā)病機(jī)制中的可能作用；尋找可能的基因突變位點(diǎn)，從基因功能調(diào)節(jié)方面進(jìn)一步探討PCOS瘦素抵抗的確切機(jī)理。 方法:1.PCOS患者62例，根據(jù)體重指數(shù)(BMI)分為肥胖PCOS組30例(BMI≥24kg/m2)和非肥胖PCOS組32例(BMI＜24kg/m2)。同時(shí)選擇年齡和體重相匹配的62

3、例月經(jīng)規(guī)律的正常婦女作為對(duì)照，根據(jù)BMI分為肥胖對(duì)照組30例和非肥胖對(duì)照組32例，用放射免疫法測(cè)定血清促黃體生成素(Luteinizinghormone，LH)、卵泡刺激素(Folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH)、睪酮(Testosterone，T)的水平；采用ELISA法測(cè)定血清瘦素(Leptin)的濃度；采用放射免疫法測(cè)定血清空腹胰島素(Fastinginsulin，F(xiàn)IN)的濃度；采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血漿

4、空腹血糖(Fastingplasmaglucose，F(xiàn)PG)；采用HOMA(Homeostasismodelassessment，HOMA)模型計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。2.留取行IVF-ET治療的PCOS患者(PCOS組，n=32例)和因輸卵管因素不孕婦女(對(duì)照組，n=32例)的卵泡液，利用ELISA法和RIA法分別測(cè)定卵泡液瘦素濃度和內(nèi)分泌指標(biāo)，觀察并記錄兩組卵細(xì)胞受精率、卵裂率。3.將來自體外受精-胚胎移植(IVF-E

5、T)的卵巢黃素化顆粒細(xì)胞純化后，在不同的濃度瘦素(0、10、20、100ng/ml)和FSH(0、1、5、10IU/ml)單獨(dú)或聯(lián)合作用下進(jìn)行體外培養(yǎng)48小時(shí)，收集培養(yǎng)液，用放射免疫方法測(cè)定顆粒細(xì)胞產(chǎn)生E2及P的濃度。4.應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(Enhancedchemiluminescence，ECL)檢測(cè)PCOS患者和正常對(duì)照組脂肪組織中JAK2和STAT3蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化程度，并進(jìn)行半定量分析；采用免疫沉淀、薄層層析

6、及γ液閃計(jì)數(shù)方法檢測(cè)JAK2激酶的活性，并進(jìn)行分析。5.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)銀染技術(shù)結(jié)合DNA直接測(cè)序，檢測(cè)PCOS患者及正常對(duì)照組的腹壁脂肪組織中瘦素受體(LEPR)基因第2、4、6、7、8、13/14、20外顯子的基因突變。 結(jié)果:1.肥胖PCOS組血清瘦素水平明顯高于非肥胖PCOS組和對(duì)照組(P＜0.01,P＜

7、0.01)；非肥胖PCOS組血清瘦素水平明顯高于非肥胖對(duì)照組(P＜0.01)，而與肥胖對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)。偏相關(guān)分析顯示PCOS患者血清瘦素水平與BMI和HOMA-IR均呈高度正相關(guān)(P＜0.01，P＜0.01)，與血FSH/LH比值和雄激素水平無相關(guān)性(P＞0.05)。2.(1)PCOS和正常組卵泡液瘦素與睪酮呈正相關(guān)(r=0.444,P＜0.01)；(2)PCOS組卵泡液瘦素水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；(3)P

8、COS組卵細(xì)胞受精率、卵裂率明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。3.(1)不同濃度的瘦素對(duì)黃素化顆粒細(xì)胞E2和P的基礎(chǔ)分泌功能無明顯影響；(2)FSH能促進(jìn)黃素化顆粒細(xì)胞E2和P的分泌，隨FSH濃度增加，E2和P的水平逐漸增高；(3)不同濃度瘦素對(duì)FSH促進(jìn)黃素化顆粒細(xì)胞E2的分泌均有抑制作用，隨瘦素濃度增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，但對(duì)P的分泌無影響。4.(1)顆粒細(xì)胞JAK2和STAT3蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化分析表明，PCOS患者酪氨酸磷酸化程度

9、與正常對(duì)照組相比均顯著下降(P＜0.05)。(2)顆粒細(xì)胞JAK2激酶的活性分析表明，PCOS患者JAK2的活性比正常對(duì)照組下降35.53％，差異具有極顯著性意義(P＜0.01)。5.24例研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)外顯子4上有位置異常的電泳條帶，經(jīng)直接測(cè)序分析，為A670→G670的純合多態(tài)性突變，即109位氨基酸由賴氨酸(K)置換成精氨酸(R)。其中PCOS患者18例，非PCOS患者6例，PCOS患者的該位點(diǎn)檢測(cè)到的A→G的多態(tài)性變異頻率明顯高于

10、年齡匹配的正常育齡婦女對(duì)照組。所有檢出第4外顯子K109R多態(tài)性的個(gè)體，其血清瘦素水平高于未檢出變異者。 結(jié)論:1.PCOS患者血清瘦素水平與BMI和血胰島素水平密切相關(guān)。PCOS患者可能同時(shí)存在瘦素抵抗和胰島素抵抗。2.PCOS患者卵泡液瘦素水平增高對(duì)卵細(xì)胞受精率、卵裂率有影響，可能是其IVF-ET妊娠成功率低的原因之一。3.瘦素抑制FSH刺激卵巢黃素化顆粒細(xì)胞雌激素的分泌，高濃度瘦素可影響卵泡發(fā)育和黃體形成。4.PCOS瘦素

11、抵抗的患者中，其發(fā)生瘦素抵抗的重要環(huán)節(jié)是由于瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，JAK2和STAT3蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化程度降低，JAK2激酶的活性降低從而減弱了瘦素信號(hào)。5.PCOS患者編碼瘦素受體胞外區(qū)的瘦素受體(LEPR)基因的第4外顯子突變頻率高于正常對(duì)照組，4外顯子K109R多態(tài)性可能與多囊卵巢綜合征有遺傳傾向的瘦素抵抗?fàn)顟B(tài)有關(guān)。 以上結(jié)論提示PCOS患者可能同時(shí)存在瘦素抵抗和胰島素抵抗；高濃度瘦素可影響卵泡發(fā)育和黃體形成，影響卵細(xì)胞受

12、精率、卵裂率，導(dǎo)致IVF-ET妊娠成功率降低；瘦素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中JAK2和STAT3的酪氨酸磷酸及JAK2激酶活性在PCOS瘦素抵抗的發(fā)生機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是PCOS病理生理改變的重要機(jī)制；PCOS患者瘦素受體基因4外顯子A670→G670的純合多態(tài)性突變可能影響瘦素受體與配體的結(jié)合，并影響瘦素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 本研究的創(chuàng)新性：1.首次從蛋白質(zhì)水平系統(tǒng)研究了PCOS發(fā)生瘦素抵抗時(shí)，JAK2和STAT3功能及活性變化，提示