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文檔簡介
1、雖然顯微外科技術已經(jīng)有了很大的進步和發(fā)展,但是對于周圍神經(jīng)損傷和再生的病理生理機制我們?nèi)匀蝗狈ι钊肓私?。周圍神?jīng)缺損的治療仍然是外科醫(yī)生的一個重大難題。準確的掌握神經(jīng)損傷修復的解剖學、病理生理學和外科重建技術是對神經(jīng)損傷修復治療的先決條件。對于大于5cm的神經(jīng)缺失,直接的神經(jīng)吻和會導致過大的張力,導致治療的失敗,需要進行自體神經(jīng)移植或者應用套管技術。對于套管技術,雖然在生物醫(yī)學工程方面取得了很大的創(chuàng)新和突破,但是由于免疫耐受的因素,仍然
2、無法有效的應用于臨床治療。自體神經(jīng)移植依然是治療神經(jīng)損傷的金標準,但是移植后修復的過程慢,壞死率高,是移植中常常遇到的問題。近年來,許多研究者發(fā)現(xiàn)NRG-1參與了神經(jīng)損傷的修復,并且發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)的作用。本研究中,為了探索NRG-1在神經(jīng)移植后修復過程中的調(diào)節(jié)作用,我們采用SD大鼠自體神經(jīng)移植模型,首先觀察了NRG-1的表達變化及移植神經(jīng)的修復過程,然后通過反義寡核苷酸技術,抑制NRG-1在自體神經(jīng)移植模型中的表達,并采用SB20358
3、0特異性抑制P38α MAPK激活,并分別觀察神經(jīng)移植后髓鞘修復及神經(jīng)功能恢復的過程,進一步分析NRG-1參與調(diào)控神經(jīng)移植后髓鞘修復的作用及其信號轉(zhuǎn)導機制。實驗分為三部分:
實驗一、NRG-1在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中的變化
目的:
研究NRG-1在大鼠自體坐骨神經(jīng)移植再生過程中的變化
方法:
采用清潔級健康雄性SD大鼠,40只,體重250-300g隨機分為實驗組和對照組,每組20只,
4、按手術后3、7、14、21、28天分為5個時間點。實驗組行坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)自體移植術,對照組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合處理,在不同時間點觀察大鼠足跡的變化,計算坐骨神經(jīng)指數(shù)(SFI),電生理檢測運動神經(jīng)傳導速度(MNCV)變化,之后分別切取實驗組移植段坐骨神經(jīng)和對照組移植對應段的坐骨神經(jīng),透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化,并通過RT-PCR技術檢測II型和III型NRG-1 mRNA的表達變化,Western blot技術檢測NRG-1
5、蛋白表達變化。
結(jié)果:
術后各個時間點的實驗組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于對照組,且實驗組坐骨神經(jīng)指數(shù)隨時間進行逐漸增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);在自體神經(jīng)移植的3-28天實驗組的坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度小于對照組,并且有統(tǒng)計學差異(P均<0.01);實驗組有髓鞘神經(jīng)纖維的面積(um2)在第7、14、21、28天與對照組比較有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01),實驗組軸突直徑在第7、14、21天與對照組比較有明顯的統(tǒng)計
6、學差異(P<0.01);RT-PCR結(jié)果分析顯示,在移植的3-28天II型NRG-1 mRNA表達均較對照組增高,且差異有統(tǒng)計學意義(P分別<0.01);Western blot結(jié)果顯示在神經(jīng)移植術后第3-28天,II型NRG-1和III型NRG-1蛋白表達也明顯增高,且有顯著性差異(P分別<0.01)。
結(jié)論:
在神經(jīng)移植后,NRG-1 mRNA及蛋白表達上調(diào),II型NRG-1和III型NRG-1表達改變不同。NR
7、G-1可能參與了神經(jīng)移植后髓鞘再生的調(diào)節(jié)過程。
實驗二、II型NRG-1在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中的作用
目的:
研究II型NRG-1在大鼠自體坐骨神經(jīng)移植再生過程中可能的作用。
方法:
采用清潔級健康雄性SD大鼠,54只,體重250-300g隨機分為空白組(Blank)、緩沖液對照組(Model)和反義寡核苷酸抑制組(ASON),每組18只,按手術后3、7、14、21、28、35天分
8、為6個時間點。緩沖液對照組和反義寡核苷酸抑制組行自體坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)移植術,在術后當日和第三天,Model組給予手術切口局部注射PBS緩沖液,ASON組給予注射II型NRG-1反義寡核苷酸;空白組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合處理。在不同時間點觀察大鼠足跡的變化,計算坐骨神經(jīng)指數(shù),電生理檢測運動神經(jīng)傳導速度。之后分別切取Model組及ASON組移植段坐骨神經(jīng)和Blank組移植對應段的坐骨神經(jīng),透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化,RT-PCR技
9、術檢測 II型NRG-1 mRNA的變化,以及通過Western blot技術檢測II型NRG-1蛋白變化,分析II型NRG-1在自體神經(jīng)移植中可能的作用。
結(jié)果:
發(fā)現(xiàn)術后ASON組除第3天以外,其余各個時間點的ASON組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于Model組的結(jié)果且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),在移植的14-35天,抑制II型NRG-1的表達,可減慢大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度。說明缺少II型NRG-1減緩自體移植神經(jīng)的再生
10、。髓鞘的形態(tài)學分析提示II型NRG-1在自體神經(jīng)移植3-28天,對髓鞘的崩解,雪旺細胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。RT-PCR和Western blot顯示:II型NRG-1的mRNA和蛋白的表達均較Model組明顯減低。
結(jié)論:
II型NRG-1在SD大鼠自體神經(jīng)后神經(jīng)再生的的過程中,在移植的3-28天,對髓鞘的崩解,雪旺細胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。缺少II型NRG-1可能影響移植后神經(jīng)功能
11、的恢復。
實驗三、P38-MAPK參與NRG-1調(diào)控大鼠自體神經(jīng)移植再生過程的機制研究
目的:
P38MAPK在大鼠自體神經(jīng)移植再生過程中對NRG-1/ErbB信號系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導作用。
方法:
采用清潔級健康雄性SD大鼠,54只,體重250-300g隨機分為空白組(Blank)、緩沖液對照組(Model)和P38α MAPK抑制組(P38α MAPK),每組18只,按手術后3、7、14、21
12、、28、35天分為6個時間點。Model組和P38α MAPK抑制組行自體坐骨神經(jīng)倒轉(zhuǎn)移植術,在術后當日和第三天,Model組給予移植切口局部注射PBS緩沖液,P38α MAPK抑制組給予注射P38α MAPK抑制劑SB2035802;空白組單純暴露坐骨神經(jīng)后縫合不對其其他實驗處理。在不同時間點觀察大鼠足跡的變化,計算SFI,電生理檢測MNCV,透射電鏡觀察移植后的神經(jīng)端髓鞘再生的變化,RT-PCR技術檢測髓鞘堿性蛋白(MBP)mRNA
13、的變化,以及通過Western blot技術檢測P-P38α MAPK蛋白變化。
結(jié)果:
SD大鼠的SFI值在移植的7、14、21、28、35五個時間點,P38α MAPK抑制組坐骨神經(jīng)指數(shù)均低于Model組。MNCV值顯示:在自體神經(jīng)移植的14、21、28、35天P38α MAPK抑制組的傳導速度小于Model組。在電鏡的髓鞘觀察和分析中有髓鞘神經(jīng)纖維的面積(um2):P38α MAPK抑制組在第28、35天出現(xiàn)與
14、Model組明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01),而前期無明顯統(tǒng)計學差異;單位面積的有髓鞘神經(jīng)纖維的數(shù)量:P38α MAPK抑制組與Model組無明顯的統(tǒng)計學差異;軸突的直徑:在第21、28、35天出現(xiàn)P38α MAPK抑制組與Model組明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01);對于G-ratio,在第28天和35天P38α MAPK抑制組均較Model組高且有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。Western blot和RT-PCR顯示:大鼠切口
15、局部注射SB203580后,MBP的mRNA:P38αMAPK抑制組的表達較Model組減少;P-P38α MAPK:P38α MAPK抑制組均較Model組少。
結(jié)論:
在SD大鼠自體神經(jīng)移植后,抑制P38α MAPK的激活,會出現(xiàn)大鼠神經(jīng)功能恢復減慢,有髓鞘神經(jīng)纖維的面積和軸突的直徑會減小,G-ratio值增加。提示在自體神經(jīng)移植模型中,P38α MAPK可能為NRG-1/ErbB信號轉(zhuǎn)導途徑的下游信號,并對神經(jīng)
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