NRG-1保護(hù)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的機制研究.pdf

1、紐蘭格林-1降低阿霉素所致的乳鼠原代心肌細(xì)胞自噬
　　 目的:研究報道阿霉素所致的心臟毒性呈累積性和劑量依賴性。發(fā)生心肌損害的癌癥患者預(yù)后一般不好,尤其在最后一次應(yīng)用阿霉素后4周以內(nèi)發(fā)病的患者,約在確診心肌病后2周以內(nèi)死亡。目前已有大量研究表明自噬在阿霉素所致心肌病和心力衰竭中起著加快疾病進(jìn)展的作用。盧等于2009年首次發(fā)現(xiàn)自噬水平異常增高在阿霉素所致心肌損傷中起著重要作用,使用自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyla

2、denine,3-MA)能抑制自噬水平,明顯改善阿霉素所致心肌病動物模型的心功能。之后人們對如何調(diào)控阿霉素引起的心肌細(xì)胞自噬進(jìn)行了一系列探討,發(fā)現(xiàn)通過在心肌細(xì)胞過表達(dá)GATA-4,可以抑制自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)水平,而上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)水平,達(dá)到抑制阿霉素所致心肌細(xì)胞自噬,改善心臟功能的目的。上述數(shù)據(jù)均表示當(dāng)使用阿霉素處理心肌細(xì)胞時,自噬可作為一種促死亡機制產(chǎn)生作用。因此調(diào)控自噬有可能成為防治阿霉素所

3、致心肌損傷的新的研究靶點。
　　 紐蘭格林-1(neuregulin-1,NRG-1)基因至少編碼15種以上的同型異構(gòu)體。而這些同型異構(gòu)體在不同的組織器官具有不同的生物活性。而到目前為止,在不同的科學(xué)研究中使用了不同的NRG-1同型異構(gòu)體。RhNRG-1是目前唯一一個在心力衰竭患者中驗證了安全性和有效性的NRG-1相關(guān)的藥物制劑。研究報道rhNRG-1改善阿霉素所致心肌病大鼠的心功能和預(yù)后,但其潛在的分子機制仍不明了。
　

4、　 因此本實驗旨在通過模擬體內(nèi)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷環(huán)境,建立阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬模型,觀察自噬在rhNRG-1保護(hù)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷中的作用,并進(jìn)行相關(guān)信號通路的分析和機制探討。
　　 方法:分離并培養(yǎng)1-2天Sprague-Dawley大鼠原代心肌細(xì)胞,將細(xì)胞隨機分為正常組、阿霉素組(1μM)、rhNRG-1組(1μg/ml)、PI3K抑制劑LY294002組(10μM)、NAC組(50μM)、Bcl-2 siRN

5、A處理組。轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒檢測細(xì)胞自噬水平。蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1的水平,凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2水平以及Akt總蛋白及其磷酸化水平。利用熒光探針DCFA-DA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。
　　 結(jié)果:本實驗結(jié)果表明rhNRG-1可以抑制阿霉素所致的細(xì)胞自噬和細(xì)胞內(nèi)ROS水平,升高凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的水平

6、,與抗氧化劑N-acetylcysteine(NAC)取得的效果大體一致。在應(yīng)用阿霉素的背景下,rhNRG-1可使蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平顯著升高。與rhNRG-1相比,加用磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)抑制劑LY294002可使Akt的磷酸化水平下降,自噬和細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,Bcl-2表達(dá)水平下降。轉(zhuǎn)染Bcl-2 siRNA(Bcl-2的小分子干擾RNA)的心肌細(xì)胞

7、中rhNRG-1對自噬的調(diào)控作用被抑制。
　　 結(jié)論:Bcl-2介導(dǎo)rhNRG-1對自噬水平的調(diào)節(jié),而rhNRG-1對Bcl-2的調(diào)節(jié)是通過PI3K/Akt/ROS信號通路來實現(xiàn)的。
　　 NRG-1通過激活PI3K-Akt信號通路抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡
　　 目的:阿霉素是目前臨床上應(yīng)用最多也是最成功的一種高效、廣譜的抗腫瘤藥物之一,常用于治療各種惡性腫瘤和白血病。像其他抗腫瘤藥物一樣,阿霉素就是一把雙刃

8、劍,在殺死癌細(xì)胞的同時也容易損傷機體組織的正常細(xì)胞。當(dāng)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷達(dá)到一定程度時會發(fā)生不可逆性心肌病,最終導(dǎo)致心力衰竭,預(yù)后很差。經(jīng)過幾十年的研究和探索,人們發(fā)現(xiàn)阿霉素引起的心肌損傷與細(xì)胞凋亡密切的關(guān)系。動物實驗證實,經(jīng)過阿霉素處理的小鼠心肌組織中發(fā)現(xiàn)了凋亡的心肌細(xì)胞。更直接的證據(jù)是,對應(yīng)用了首劑量阿霉素的腫瘤患者進(jìn)行心內(nèi)膜活檢,取活檢組織進(jìn)行電鏡分析,發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞凋亡的證據(jù):線粒體腫脹,染色質(zhì)聚集。Popelová等發(fā)現(xiàn)阿霉素

9、治療的輔助用藥右雷佐生,之所以能夠起到保護(hù)心臟的作用,根本原因是因為其能夠完全抑制阿霉素所致的細(xì)胞凋亡及其相關(guān)信號分子,該藥的抗凋亡能力比其抗氧化能力更強。這些證據(jù)提示我們可以通過藥物來調(diào)控細(xì)胞調(diào)亡水平達(dá)到防治阿霉素所致心肌損傷的目的。
　　 NRG-1與心臟發(fā)育和功能維持有密切關(guān)系,研究報道)阿霉素可以降低體外實驗中心肌組織NRG-1mRNA表達(dá)水平致使NRG-1/ErbB信號系統(tǒng)活性降低。rhNRG-1是目前唯一一個在心力衰

10、竭患者中驗證了安全性和有效性的與NRG-1相關(guān)的藥物制劑。研究報道rhNRG-1改善阿霉素所致心肌病大鼠的心功能和預(yù)后,但其潛在的分子機制仍不明了。PI3K/Akt途徑是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號通路。因此本實驗旨在通過模擬體內(nèi)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷環(huán)境,建立阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型,并假設(shè)rhNRG-1能通過PI3K/Akt通路抑制凋亡而保護(hù)阿霉素所致心肌損傷
　　 方法:分離并培養(yǎng)1-2天Sprague-Dawley大鼠乳鼠

11、原代心肌細(xì)胞,將細(xì)胞隨機分為正常組、阿霉素組(1μM)、不同濃度梯度rhNRG-1組(10ng/ml-1000ng/ml)、PI3K抑制劑LY294002組(10μM)。TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡水平,蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C水平及Akt總蛋白及其磷酸化水平。
　　 結(jié)果:本實驗結(jié)果表明rhNRG-1呈濃度依賴性升高阿霉素誘導(dǎo)的低水平心肌細(xì)胞活性。特別是10