NRG1-ErbB4信號通路抑制大鼠深低溫停循環(huán)后神經(jīng)損傷的相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的：
　　深低溫停循環(huán)(DHCA)技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于主動脈外科和復(fù)雜先天性心臟病手術(shù)中，因其可提供短時間相對無血的手術(shù)視野而成為心血管外科現(xiàn)今無可取代的手術(shù)技術(shù)之一。然而較長時間的DHCA則可引起多種術(shù)后近期或遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，影響術(shù)后恢復(fù)。隨著DHCA技術(shù)應(yīng)用日益廣泛，此類報道也日益增多。因此進(jìn)一步探究DHCA后腦損傷的相關(guān)機(jī)制以求改善患者術(shù)后的生存質(zhì)量是仍是目前心血管外科領(lǐng)域的研究熱點之一。
　　導(dǎo)致DHCA后中樞神

2、經(jīng)系統(tǒng)損傷的直接原因包括缺血及缺氧，由此進(jìn)而激活多方面的損傷機(jī)制如能量耗竭、氨基酸興奮毒性、炎性損傷等反應(yīng)，上述機(jī)制通過獨立或相互協(xié)同作用，最終引起神經(jīng)細(xì)胞的壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)。二者作為神經(jīng)細(xì)胞損傷的終末環(huán)節(jié)，目前更為普遍的研究結(jié)果表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡（或程序性細(xì)胞死亡）對DHCA后患者早期神經(jīng)系統(tǒng)功能的不利影響較壞死更為重要，因為DHCA后神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程明顯早于壞死的發(fā)生。而在新生大腦DHCA模型中，

3、由凋亡途徑產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡比例甚至大于壞死比例。因此在DHCA后早期內(nèi)給予有效手段干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能成為改善患者預(yù)后的途徑之一。
　　由于DHCA過程涉及多種損傷機(jī)制，因此引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的途徑亦是多元化的。缺血和缺氧導(dǎo)致的谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)過度積累激活可NMDA、AMPA及等受體，鈣離子大量內(nèi)流，進(jìn)而激活磷脂酶、蛋白激酶以及一氧化氮合酶等，造成興奮毒性損傷，啟動凋亡程序;此外，與DHCA相關(guān)的炎癥損傷也是觸發(fā)凋亡的重要機(jī)制之一。

4、凋亡程序的啟動伴隨著多種促凋亡蛋白的合成增加，如caspase-3，caspase-8，F(xiàn)as，F(xiàn)as-L以及DR6等，此外與凋亡相關(guān)的調(diào)控蛋白如Bcl-2、bax等的合成比例也有顯著變化。與單純腦缺血損傷相比，DHCA對凋亡通路最主要的影響表現(xiàn)為Bcl-2表達(dá)的下降以及caspase-3蛋白的合成增加，而大腦額葉皮層及海馬處的其他多數(shù)凋亡相關(guān)蛋白并無顯著改變。與此同時，這些凋亡通路中關(guān)鍵蛋白的合成又受細(xì)胞內(nèi)外多種信號通路的調(diào)節(jié)和影響。

5、
　　Neuregulin(NRG)是表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)、心肌等組織的一種信號蛋白，其作為配體可結(jié)合于細(xì)胞表面ErbB受體，引起其構(gòu)象改變形成二聚體，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)絡(luò)氨酸激酶及下游一系列信號通路如PI3K/Akt、c-Raf/E RK等，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、存活等過程。近幾年來NRG1/ErbB4及其下游的信號通路被認(rèn)為密切參與了多種組織缺血損傷后的細(xì)胞凋亡過程。NRG還可有效降低缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因如IL-1β的表達(dá)并參與

6、抑制炎癥反應(yīng)?？梢娚鲜鯪RG1/ErbB4及其下游的信號通路與DHCA后神經(jīng)損傷機(jī)制存在理論上的相關(guān)性，而該方面研究尚無明確報道。
　　此外，炎性損傷也是DHCA后腦損傷產(chǎn)生的重要原因之一。DHCA后腦內(nèi)炎性因子水平升高，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增殖。DHCA后氧化應(yīng)激反應(yīng)使ROS生成增多。最新研究表明，ROS可激活NLRP3炎癥小體，并觸發(fā)一種不同于壞死和凋亡的pyroptosis（亦稱細(xì)胞焦亡）程序性死亡過程，其特征為依賴于caspas

7、e-1(半胱天冬酶-1)，并伴有大量促炎癥因子的釋放。各種刺激信號通過不同途徑激活caspase-1，caspase-1繼而作用于其底物導(dǎo)致細(xì)胞滲透性腫脹，胞內(nèi)物質(zhì)流出，IL-1β、IL-18前體裂解、釋放促炎因子是細(xì)胞焦亡發(fā)生的機(jī)制。作為一種伴隨炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，pyroptosis的意義并不亞于凋亡。DHCA引起的神經(jīng)損傷是否伴隨pyroptosis的發(fā)生，以及NRG1/ErbB4信號通路是否參與其調(diào)節(jié)亦無相關(guān)報道。
　

8、　因此，本研究以大鼠為對象，采用HE、Nissl、TUNEL染色、免疫組化、Westernblot等方法，探究NRG1/ErbB4信號通路對大鼠DHCA后神經(jīng)損傷的影響，并分別從干預(yù)凋亡通路角度如PI3K/Akt、c-Raf/ERK及其作用蛋白CREB、bcl-2以及抑制神經(jīng)細(xì)胞炎性損傷的角度對NRG1/ErbB4信號通路腦保護(hù)的機(jī)制展開深入探討。
　　方法：
　　健康雄性Sprague-Dawley大鼠（體重350-400

9、g）5只作為對照組;健康雄性Sprague-Dawley大鼠15只，隨機(jī)分為3組作為實驗組:DHCA組(60min)、Neuregulin-1β2.5ng/kg組(NRG-L組)、Neuregulin-1β3.75ng/kg組(NRG-H組)。各組大鼠均常規(guī)行全麻、氣管插管、左頸外靜脈及右頸動脈置管。實驗組大鼠均行體外循環(huán)轉(zhuǎn)流及DHCA60min。術(shù)后8h各組大鼠斷頭處死，迅速取出大腦，一半放入4％多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，用

10、于常規(guī)HE染色、尼氏染色、TUNEL染色及cleaved caspase-3、pCREB等指標(biāo)免疫組化的檢測，另一半用于SOD、GSH-Px酶活性、MDA含量的測定，Western blot印跡分析NRG1、ErbB4受體、PI3K、Akt、c-Raf、ERK、CREB、blc-2、NLRP3、ASC、caspase-1等蛋白表達(dá)水平，ELISA法檢測IL-1β和IL-18分泌水平以及q-PCR檢測Bcl-2 mRNA、IL-1β mR

11、NA、IL-18 mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1、外源性neuregulin-1β對大鼠腦組織病理改變的影響
　　HE染色及Nissl染色結(jié)果示，DHCA后大鼠大腦皮層及海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，壞死神經(jīng)元可見，細(xì)胞排列較疏松，尼氏體界線模糊;而NRG-L組、NRG-H組神經(jīng)元損傷程度均明顯減少。
　　2、外源性neuregulin-1β對DHCA大鼠腦內(nèi)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響
　　

12、免疫組化及Western Blot結(jié)果示可見，DHCA后大鼠大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上升;NRG-L組、NRG-H組大鼠大腦皮層及海馬區(qū)的cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　3、外源性neuregulin-1β對DHCA后大鼠腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　TUNEL法染色結(jié)果顯示DHCA后大鼠腦區(qū)存在較多凋亡細(xì)胞，與對照組相比，DHCA組凋亡指數(shù)增高;n

13、euregulin-1β可明顯抑制NRG-L組、NRG-H組大鼠DHCA后腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。
　　4、neuregulin-1β對DHCA后大鼠腦內(nèi)NRG1/ErbB4通路的影響
　　與對照組相比， DHCA組大鼠腦內(nèi)NRG-1蛋白及其受體ErbB4蛋白表達(dá)水平明顯下降，而NRG-L組、NRG-H組大鼠腦內(nèi)NRG-1蛋白及ErbB4受體蛋白表達(dá)水平明顯升高，這提示外源性NRG-1β可激活大鼠腦內(nèi)NRG1/ErbB4信號通路

14、。
　　5、NRG1/ErbB4受體信號通路的激活對其下游c-Raf/ERK信號通路的影響
　　DHCA組大鼠海馬內(nèi)c-Raf和ERK蛋白磷酸化水平明顯降低，而總蛋白水平基本保持不變，磷酸化蛋白與總蛋白比值明顯降低;而與DHCA組對比，NRG-L組、NRG-H組可增加DHCA組大鼠海馬內(nèi)c-Raf、 ERK蛋白的磷酸化水平，而并不改變總蛋白的水平，磷酸化蛋白與總蛋白比值明顯升高。
　　6、NRG1/ErbB4受體信號通

15、路的激活對其下游PI3K/Akt信號通路的影響
　　結(jié)果顯示，與對照組比，DHCA組大鼠海馬內(nèi)PI3K和AKT磷酸化水平明顯降低，而總蛋白水平基本保持不變，磷酸化蛋白與總蛋白比值明顯降低;而與DHCA組對比，NRG-L組、NRG-H組大鼠海馬內(nèi)PI3K和AKT的磷酸化水平較DHCA組明顯增加，而并不改變總蛋白的水平，磷酸化蛋白與總蛋白比值明顯升高。
　　7、NRG1/ErbB4受體信號通路的激活對PI3K/Akt、c-Raf

16、/ERK信號通路下游效應(yīng)蛋白CREB、bcl-2的影響
　　Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比，DHCA組大鼠海馬內(nèi)CREB的磷酸化蛋白表達(dá)水平明顯降低，而與DHCA組對比，NRG-L組、NRG-H組大鼠海馬CREB的磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著升高，總蛋白無顯著改變。
　　結(jié)論：
　　1.DHCA后相關(guān)的缺血缺氧損傷可引起大鼠腦內(nèi)NRG1/ErbB受體信號通路失活，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　2

17、.外源性neuregulin-1β可通過抑制大鼠DHCA后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善海馬及皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　3.Neuregulin-1β通過上調(diào)大鼠腦內(nèi)NRG1及其受體ErbB4的表達(dá)水平激活NRG1/ErbB受體信號通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　4.活化的NRG1/ErbB4受體信號通路通過激活PI3K/Akt信號通路和c-Raf/ERK信號通路，調(diào)節(jié)其共同的下游效應(yīng)蛋白CREB，進(jìn)而增加凋亡相關(guān)蛋白Bc

18、l-2 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平，最終發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。
　　5.由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS通過激活NLRP3炎癥小體介導(dǎo)了DHCA后大鼠神經(jīng)細(xì)胞pyroptosis，產(chǎn)生神經(jīng)炎性損傷。
　　6.NRG1/ErbB4受體信號通路的激活可通過干預(yù)NLRP3炎癥小體激活抑制caspase-1蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少IL-1β及IL-18前體向活性IL-1β及IL-18轉(zhuǎn)化，最終減輕DHCA后神經(jīng)細(xì)胞pyroptosis損傷，發(fā)揮神