腫瘤干細(xì)胞在人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375耐順鉑效應(yīng)中的作用.pdf

1、研究背景：
　　皮膚惡性黑色素瘤是常見的一種惡性腫瘤，順鉑（cisplatin，CDDP）是治療皮膚惡性黑色素瘤的主要化療藥物。皮膚黑色素瘤細(xì)胞對(duì) CDDP的敏感性較低，容易對(duì)CDDP產(chǎn)生獲得性耐藥，其機(jī)制目前尚不明確。盡管許多研究對(duì)皮膚惡性黑色素瘤的耐藥性進(jìn)行了細(xì)致的探討，但是腫瘤干細(xì)胞（cancer stemcells，CSCs）在上述過(guò)程中的作用并不清楚。CSCs是腫瘤組織包含的具有自我更新和分化能力的一小類細(xì)胞，對(duì)腫瘤的發(fā)

2、生發(fā)展起著重要的作用，被認(rèn)為是產(chǎn)生腫瘤組織的細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，CSCs是多種腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥的重要機(jī)制之一。由此我們推測(cè)，CSCs有可能是皮膚惡性黑色素瘤對(duì)CDDP產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一。
　　為確定CSCs是否參與了皮膚惡性黑色素瘤對(duì)CDDP的耐藥過(guò)程，本研究首先采用人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375建立了耐CDDP的人黑色素瘤細(xì)胞系（CDDP-R A375），鑒定了CDDP-R A375對(duì)CDDP的耐藥性，檢測(cè)了干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)和C

3、DDP-R A375的多藥耐藥性，采用As2O3逆轉(zhuǎn)了CDDP-R A375的耐藥性后，再次檢測(cè)了干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)和CDDP-R A375的多藥耐藥性。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.采用大劑量沖擊和逐步增加劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)人惡性皮膚黑色素瘤耐藥細(xì)胞系CDDP-R A375。
　　2.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)了CDDP-R A375細(xì)胞的增殖能力。
　　3.采用MTT法觀察了CDDP-R A375和正常A375（WTA

4、375）細(xì)胞對(duì)CDDP、氮烯咪胺（dacarbazine,DTIC）和紫杉醇的敏感性。
　　4.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞的表達(dá)。
　　5.MTT法檢測(cè)了As2O3對(duì)CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞的毒性。
　　6.As2O3（0.2mg/L）預(yù)處理后，MTT法觀察了CDDP-R A375細(xì)胞對(duì)CDDP、氮烯咪胺（dacarbazin

5、e,DTIC）和紫杉醇敏感性的變化，并采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375細(xì)胞表達(dá)的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.同WT A375細(xì)胞比較，CDDP-R A375細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著改變（P>0.05）。CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為38.5 h和36.2 h，兩者無(wú)明顯差異。
　　2.在含有CDDP（4mg/L）的培養(yǎng)液中，在第3、4、5

6、和6d，CDDP-R A375細(xì)胞的增長(zhǎng)速率顯著高于WT A375細(xì)胞（P<0.05），在第1和2d，兩種細(xì)胞之間的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異（P>0.05）。同正常培養(yǎng)液中的WT A375細(xì)胞比較，含CDDP（4mg/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)的CDDP-RA375細(xì)胞的增殖速率無(wú)顯著改變（P>0.05）；CDDP濃度為0.004和0.04mg/L時(shí)，CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞增長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異（P>0.05），但是CDDP濃度為0.4、

7、4和40mg/L時(shí)，CDDP-R A375細(xì)胞的生長(zhǎng)速率顯著高于WT A375細(xì)胞（P<0.01）；CDDP-R A375和WT A375對(duì)CDDP的IC50分別為62.9mg/L和4.23mg/L，耐藥指數(shù)為14.87。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)液中的DTIC濃度在0.01、0.1和1mg/L時(shí)，CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞之間的生長(zhǎng)率無(wú)顯著差異（P>0.05），DITC濃度增加為10和100mg/L時(shí)，CDDP-R A3

8、75細(xì)胞的生長(zhǎng)率顯著高于WT A375細(xì)胞（P<0.05），CDDP-R A375和WT A375對(duì)DTIC的IC50分別為1881mg/L和293mg/L，耐藥指數(shù)為6.42；培養(yǎng)液中的紫杉醇濃度在0.001和0.01mg/L時(shí)，CDDP-R A375和WT A375細(xì)胞之間的生長(zhǎng)率無(wú)顯著差異（P>0.05），紫杉醇濃度增加為0.1、1和10mg/L時(shí)，CDDP-R A375細(xì)胞的生長(zhǎng)率顯著高于WT A375細(xì)胞（P<0.05），CD

9、DP-R A375和WT A375對(duì)紫杉醇的IC50分別為8.2mg/L和1.6mg/L，耐藥指數(shù)為5.13。
　　4.相對(duì)于WT A375細(xì)胞，CDDP-R A375細(xì)胞中SOX-2、OCT-4和CD133的表達(dá)均顯著增加（P<0.05）。
　　5.0.25 mg/L的As2O3對(duì)CDDP-R A375和WTA375細(xì)胞無(wú)毒性反應(yīng)，但是當(dāng)濃度超過(guò)0.25mg/L時(shí)，As2O3呈現(xiàn)出劑量依賴性的毒性效應(yīng)。
　　6.0.

10、20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對(duì)CDDP的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.81，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為47.5％；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對(duì)DTIC的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.63，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為44.3%；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375對(duì)紫杉醇的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.57，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率為43.7%；0.20 mg/L的As2O3預(yù)處理后，CDDP-R A375細(xì)胞中SOX