血管活性腸肽介導(dǎo)人食管下括約肌舒張的實驗研究.pdf

1、目的:人食管下括約肌(lower esophageal sphincter,LES)是位于胃食管接合部特殊增厚的環(huán)形肌,寬度大約2～3cm。Liebermann-Meffert首次提出人食管下括約肌由位于大彎側(cè)呈斜行分布的套索纖維(sling fibres)和位于胃小彎側(cè)呈半環(huán)形的鉤狀纖維(clasp fibres)共同構(gòu)成,這兩個結(jié)構(gòu)造成LES的收縮與舒張,并在胃食管連接部形成一個高壓帶(15～30minHg)。食管測壓實驗發(fā)現(xiàn)人LE

2、S的壓力是不對稱的,高壓區(qū)偏向左側(cè),即套索纖維方向[2,3],顯然套索纖維和鉤狀纖維在維持LES壓力方面發(fā)揮不同作用,但二者作用區(qū)別尚未完全明確。人LES的正常功能是由抑制性和興奮性神經(jīng)、體液因素以及LES本身的肌源因素等共同調(diào)節(jié),保證當(dāng)吞咽時食管下括約肌舒張并具有抗反流的作用。其中抑制性神經(jīng)即非腎上腺非月旦堿能(nonadrenergic noncholinergic,NANC)神經(jīng)的神經(jīng)遞質(zhì)目前還處于研究階段,一氧化氮(NO)被認(rèn)為

3、是其中一種神經(jīng)遞質(zhì),而血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是否是NANC神經(jīng)遞質(zhì)之一尚在爭議當(dāng)中。國外研究發(fā)現(xiàn)外源性VIP在一定濃度下能顯著降低動物如貓、狗、負(fù)鼠等LES的肌張力,尚未證實其對人LES的作用,并未區(qū)分套索纖維與鉤狀纖維的作用效果。本實驗研究VIP對人LES套索纖維和鉤狀纖維的作用及其差異,并且探索VIP是否屬于NANC神經(jīng)遞質(zhì),從而進(jìn)一步了解人LES的生理及藥理特性,為食管運(yùn)

4、動功能障礙性疾病的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:選取2010年3月到2010年8月在我院因高位食管中段癌行食管大部切除術(shù)患者30例,其中男、女各半,平均年齡58歲。術(shù)中由術(shù)者切取食管胃連接部上下3cm作為研究標(biāo)本(該部位屬于食管中段癌手術(shù)切除范圍之內(nèi),切取該部位作為研究標(biāo)本不會對手術(shù)效果造成任何影響),并在胃大彎側(cè)標(biāo)記,以防止錯誤游離。術(shù)者切下標(biāo)本后立即將標(biāo)本放入盛有4℃Krebs液的燒杯中,迅速送入實驗室。實驗室室溫下將

5、標(biāo)本以解剖位置固定在盛有Krebs液的蠟盤上,持續(xù)向蠟盤的Krebs液內(nèi)通以5％CO2和95％O2混合氣體。沿食管胃長軸通過胃大彎標(biāo)記點切開標(biāo)本,將標(biāo)本展開,粘膜面向上固定在蠟盤上。使用剪刀銳性剝離胃賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層,此時位于食管胃交界處的發(fā)白增厚的肌肉環(huán)即為食管下括約肌。肉眼識別出鉤狀纖維與套索纖維。鉤狀纖維位于標(biāo)本的中央呈半環(huán)形分布,套索纖維位于標(biāo)本的兩端并呈斜行分布。銳性游離鉤狀纖維和套索纖維,制備2mm×10m

6、m的肌條。用絲線將肌條兩端分別扎緊,置于10ml規(guī)格的灌流槽中,灌流槽內(nèi)提前注入Krebs液10ml,持續(xù)通以5％CO2和95％O2的混合氣體,并保持37℃恒溫。肌條上端經(jīng)絲線連接于肌肉張力換能器,下端經(jīng)絲線固定于帶鉑金電極的L形固定架上,張力信號由Medlab信號采集系統(tǒng)記錄。肌條位于兩個平行的環(huán)形鉑金電極中間,肌條上下端與電極環(huán)間的距離在3mm以上,鉑金電極經(jīng)導(dǎo)線連接于藥理生理實驗多用儀行電場刺激(electric field st

7、imulation,EFS)?？焖倮旒l至產(chǎn)生200mg張力,此時肌條的長度作為初長度L0,然后每15min緩慢牽拉肌條一次使其增加初長度L0的25％,直至肌條達(dá)到200％L0作為最適初長度,平衡1h。刺激參數(shù):單脈沖方波、波寬5ms、電壓50V、頻率1～32Hz以倍數(shù)遞增。標(biāo)本平衡1h后,以頻率1hZ～32hz行電場刺激,只有對電場刺激反應(yīng)良好的肌條才能繼續(xù)使用。待肌條恢復(fù)平衡后,向浴槽中加入VIP(10-28)(10-5mol/L

8、),對照組加等量蒸餾水,觀察肌條張力變化。對未行電場刺激的肌條,加入不同濃度的外源性VIP(10-9～10-6mol/L),建立4輪VIP累計給藥的濃度.反應(yīng)量效曲線。每輪之間間隔時間為肌條平衡后10分鐘。待第4輪加藥肌條反應(yīng)平衡后10分鐘,將VIP(10-28)(10-5mol/L)加入浴槽中。并觀察外源性VIP影響下,VIP(10-28)(10-5mol/L)對套索纖維和鉤狀纖維是否會發(fā)生肌條張力變化的作用。同時設(shè)對照組,向未行任何

9、實驗的肌條浴槽中加入VIP(10-28)(10-5mol/L),觀察加藥后套索纖維和鉤狀纖維的肌條張力變化。EFS和藥物誘發(fā)的舒張反應(yīng)均以肌條舒張百分比的mean±SD表示。兩條濃度-反應(yīng)量效曲線之間的比較,采用雙因素方差分析,當(dāng)F值有顯著性(P＜0.05)時,進(jìn)一步采用Bonferroni's test檢驗比較兩對應(yīng)濃度間的藥物效應(yīng)。統(tǒng)計學(xué)分析及圖形處理使用Spass13.0和GraphPad Prism軟件。
　　 結(jié)果:<

10、br>　　 1 外源性VIP對人食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維的影響外源性VIP(10-9～10-6mol/L)不同濃度下均可使套索纖維和鉤狀纖維產(chǎn)生濃度依賴性舒張反應(yīng),二者在相同VIP濃度下(10-9～10-6mol/L)張力變化的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),套索纖維舒張程度明顯大于鉤狀纖維。
　　 2 外源性VIP作用下,VIP(10-28)對人食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維的影響
　　 VIP(10-28

11、)能夠短暫一過性抑制外源性VIP的作用,表現(xiàn)為加藥后,原本在外源性VIP作用下表現(xiàn)為舒張的套索纖維和鉤狀纖維肌條,均出現(xiàn)短暫一過性的收縮,肌條張力增大。對照組肌條張力無任何變化。
　　 3 EFS作用下,VIP(10-28)對人食管下括約肌套索纖維和鉤狀纖維的影響VIP(10-28)(10-5mol/L)對EFS作用后的套索纖維和鉤狀纖維均產(chǎn)生了短暫一過性的抑制作用,表現(xiàn)為加藥后套索纖維和鉤狀纖維肌條均出現(xiàn)短暫一過性的收縮,肌條

12、張力增大。而蒸餾水對照組肌條張力無明顯變化。
　　 結(jié)論:本實驗研究VIP對人LES套索纖維和鉤狀纖維的作用及其差異,并且探索VIP是否是人LES內(nèi)NANC神經(jīng)遞質(zhì),發(fā)現(xiàn)VIP作用于人LES套索纖維和鉤狀纖維能使之產(chǎn)生濃度依賴性舒張反應(yīng),套索纖維和鉤狀纖維在相同濃度下舒張變化的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,套索纖維的舒張作用大于鉤狀纖維;電場刺激EFS誘導(dǎo)鉤狀纖維和套索纖維的舒張與VIP有關(guān),實驗結(jié)果支持VIP是人LES內(nèi)NANC神經(jīng)遞質(zhì)