卵泡抑素對(duì)豬著床前胚胎體外發(fā)育的影響.pdf

1、豬胚胎工程在畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)基礎(chǔ)研究等方面均具有重要的科學(xué)意義和廣闊的應(yīng)用前景。但作為影響豬胚胎早期發(fā)育效率與質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，豬胚胎體外培養(yǎng)體系仍然不理想。已知作為T(mén)GF-β超家族的一員，卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）可有效地促進(jìn)牛和猴子早期胚胎的發(fā)育。然而 FST對(duì)豬早期胚胎發(fā)育是否有作用鮮有報(bào)道。為了深入探討 FST對(duì)豬早期胚胎體外發(fā)育的影響，完善豬胚胎體外培養(yǎng)方案，本研究開(kāi)展了如下試驗(yàn)：
　　試驗(yàn)一：為了

2、探明 FST對(duì)體外胚胎形成可能的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了豬卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段的豬孤雌激活胚(parthenogenetic activationembryo,PAE)、體外受精胚(in vitro fertilization embyo, IVFE)中FST mRNA的表達(dá)豐度及其蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR, RT-qPCR）結(jié)果顯示，豬卵母細(xì)胞和早期胚胎的各個(gè)發(fā)育階段均

3、有FST mRNA的表達(dá)。FST mRNA隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升，在PAEs和IVF Es的2、4和8-ce ll階段表達(dá)豐度顯著下降，而到了囊胚期，胚胎中FST mRN A表達(dá)豐度又明顯上升。間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，F(xiàn)S T蛋白從受精（或激活）后開(kāi)始顯著上升，并在4-ce ll期達(dá)到峰值，之后隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行而顯著下降，整體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。結(jié)果表明，豬卵母細(xì)胞及早期胚胎中均有FST mRNA及其蛋白表達(dá)，說(shuō)明FST

4、對(duì)卵泡發(fā)育和早期胚胎發(fā)育可能有影響。
　　試驗(yàn)二：為揭示不同亞型的FST蛋白對(duì)豬PAEs早期胚胎著床前體外發(fā)育的影響，我們將PAEs隨機(jī)置于分別添加10ng/mL FST-288、FST-300、FST-315蛋白的PZM-3培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不加任何FST的PZM-3為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵裂率方面，與對(duì)照組相比，添加FST-300能顯著提高豬PAEs早期卵裂率和總卵裂率（P＜0.05）；而添加FST-315雖然也能顯著提高總卵裂率

5、，但早期卵裂率提高不顯著。囊胚形成方面，不管是全程添加還是半程添加，添加FST-300均能顯著提高胚胎的囊胚率（P＜0.05），添加FST-315也能改善囊胚形成率，但差異不顯著。在囊胚質(zhì)量方面，除了全程添加FST-315組的ICM細(xì)胞數(shù)顯著下降外，其他組之間都未見(jiàn)明顯改變。結(jié)果表明，添加10ng/mL的FST-300能顯著促進(jìn)初次卵裂時(shí)間的提前及囊胚形成率的提高，但對(duì)囊胚質(zhì)量無(wú)明顯影響。
　　試驗(yàn)三：為進(jìn)一步闡明FST-315蛋

6、白對(duì)豬早期胚胎著床前體外發(fā)育的影響，同時(shí)研究 FST對(duì)不同類(lèi)型的胚胎其作用是否一致，我們分別在 PAEs和核移植胚(nuclear transferembryo, NTE)的體外培養(yǎng)過(guò)程中，在PZM-3中全程添加0（對(duì)照組）、1、10、100ng/mL的FST-315蛋白，通過(guò)監(jiān)測(cè)卵裂率、囊胚率和囊胚質(zhì)量來(lái)評(píng)價(jià)其作用效果。結(jié)果顯示，不管是PAEs還是NTEs，各組之間的卵裂率和囊胚形成率均無(wú)顯著差異，但1ng/mL組囊胚總細(xì)胞數(shù)和 TE

7、細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組。有趣的是，添加1 ng/mL FST-315能顯著提高NTEs的早期卵裂率，但對(duì)PAEs并沒(méi)有明顯影響。結(jié)果表明，添加FST-315對(duì)豬早期胚胎發(fā)育有影響，主要表現(xiàn)在影響其囊胚質(zhì)量。
　　試驗(yàn)四：為探討不同濃度 FST-300蛋白對(duì)豬 NTEs胚胎著床前體外發(fā)育的影響，我們?cè)赑ZM-3中全程添加5、10、20 ng/mL的FST-300蛋白，不加FST-300的PZM-3為對(duì)照組，通過(guò)采集卵裂率、囊胚率和囊胚

8、總細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)其培養(yǎng)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，各組的早期卵裂率、總卵裂率以及囊胚總細(xì)胞數(shù)、ICM細(xì)胞數(shù)和TE細(xì)胞數(shù)并未顯著改變。但20 ng/mL組能顯著提高其囊胚率，雖然5 ng/mL和10 ng/mL組也能提高其囊胚率，但差異不顯著。結(jié)果表明，10ng/mL的添加濃度并不是FST-300在豬核移植胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中的最適濃度，需要適當(dāng)提高。
　　試驗(yàn)五：為揭示不同F(xiàn)ST-300處理時(shí)間對(duì)豬NTEs胚胎發(fā)育的影響，我們?cè)谂咛?/p>

9、體外培養(yǎng)的前30h、48h和60h添加10ng/mL FST-300蛋白進(jìn)行處理，之后轉(zhuǎn)移到未添加FST-300的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)立全程未添加組為對(duì)照，比較其對(duì)NTEs胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管在最初胚胎培養(yǎng)的什么時(shí)間（如30h、48 h和60 h）添加10ng/mL FST-300，囊胚率均顯著高于對(duì)照組，但各組之間的囊胚細(xì)胞數(shù)、ICM細(xì)胞數(shù)和TE細(xì)胞數(shù)差異不顯著。結(jié)果暗示，F(xiàn)ST-300對(duì)于豬早期胚胎發(fā)育的影響，主要發(fā)生在胚

10、胎基因組激活之前。
　　綜上所述，本研究首次揭示了豬卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段的PAE s和 I VF Es中FST mRNA的表達(dá)豐度及蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。在促進(jìn)豬著床前胚胎體外培養(yǎng)方面，不管是PAEs還是NTEs，以20ng/mL FST-300蛋白至少處理30h在囊胚形成率方面效果最好，而以1ng/mL FST-315處理在提高囊胚質(zhì)量方面效果最好。總之，本研究首次證實(shí)FST對(duì)豬早期胚胎的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，但這種促進(jìn)作用因F