重組血管活性腸肽質(zhì)粒治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察重組血管活性腸肽(pcDNA3.1+/VIP)質(zhì)粒治療膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎(CIA)血清TNF-α、IL-2、IL-4表達(dá)的影響和病理變化，探討VIP基因治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效果及可能機(jī)制，為VIP基因治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取SD雄性大鼠48只隨機(jī)分成8組，每組6只，以牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑以1∶1比例混合的乳化劑于大鼠背部皮下多點(diǎn)注射誘導(dǎo)建立CIA大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?0d后取0.1ml同上乳化劑在大鼠尾

2、根部皮內(nèi)注射再次致敏，以重組血管活性腸肽質(zhì)粒(pcDNA3.1+/VIP)13μl關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療CIA，共3次(間隔7d)。觀察大鼠生長(zhǎng)情況，定期評(píng)分。于第50d稱重后分別采集各組大鼠血液，分離血清，-20℃保存，待檢測(cè)細(xì)胞因子；脫頸椎處死大鼠，分離后肢致炎病變關(guān)節(jié)，10％甲醛固定，待進(jìn)行病理觀察。 二、病理觀察大鼠后肢致炎病變關(guān)節(jié)，依次經(jīng)過10％甲醛固定、EDTA脫鈣、乙醇梯度脫水、常規(guī)包埋及切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，

3、鏡檢觀察組織病理變化。正常大鼠相同關(guān)節(jié)部位作對(duì)照。 三、細(xì)胞因子檢測(cè)血清細(xì)胞因子測(cè)定：TNF-α和IL-2及IL-4的測(cè)定均按照ABC-ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行，即分別將待測(cè)大鼠血清標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)孔中(100μl/孔)，并以正常大鼠血清作對(duì)照，37℃孵育90min，加入生物素結(jié)合的抗體，37℃孵育60min，0.01molpH7.2PBS洗板3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min，洗板5次后

4、加入底物TMB，37℃避光顯色8～12min后加入2molH2SO4終止反應(yīng)，上機(jī)450nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。 結(jié)果：一、病理切片顯示CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生明顯，絨毛狀突向關(guān)節(jié)腔，排列紊亂，部分滑膜剝脫缺失，有新生血管翳形成，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟組織明顯水腫，關(guān)節(jié)間隙增寬，嚴(yán)重者骨及軟骨破壞。經(jīng)過VIP質(zhì)粒治療的大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組顯著減輕。 二、細(xì)胞因子測(cè)定：①

5、重組pcDNA3.1+/VIP質(zhì)粒治療對(duì)CIA大鼠血清TNF-α水平的影響：與正常對(duì)照組相比較，CIA模型組、空質(zhì)粒預(yù)防組、空質(zhì)粒治療組、空白對(duì)照組TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)；重組VIP質(zhì)粒治療各組血清TNF-α水平均較非VIP治療組明顯降低(P＜0.05)。裸VIP質(zhì)粒治療組與Lip-VIP治療組相比，無明顯差異(P＞0.05)。 ②重組pcDNA3.1+/VIP質(zhì)粒治療對(duì)CIA大鼠血清IL-2水平的影響：與正常對(duì)

6、照組相比，CIA模型組、空質(zhì)粒預(yù)防組、空質(zhì)粒治療組、空白對(duì)照組IL-2水平明顯升高(P＜0.05)；重組VIP質(zhì)粒治療各組血清IL-2水平均較非VIP治療組有明顯降低(P＜0.05)，裸VIP質(zhì)粒與Lip-VIP治療組相比，無明顯差異(P＞0.05)。 ③重組pcDNA3.1+/VIP質(zhì)粒治療對(duì)CIA大鼠血清IL-4水平的影響：與正常對(duì)照組相比，CIA模型組、空質(zhì)粒預(yù)防組、空質(zhì)粒治療組、空白對(duì)照組IL-4水平明顯降低，(P＜0.

7、05)，重組VIP質(zhì)粒治療各組血清IL-4水平較非VIP治療組明顯升高(P＜0.05)，裸VIP質(zhì)粒與Lip-VIP治療組相比，無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：重組血管活性腸肽質(zhì)粒關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎，能顯著減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀和關(guān)節(jié)炎性病理改變；抑制前炎性細(xì)胞因子(TNF-α)的表達(dá)和Th1型細(xì)胞的分化，促進(jìn)Th2型細(xì)胞的分化，上調(diào)抗炎因子IL-4的表達(dá)。研究進(jìn)一步證明炎癥反應(yīng)和Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的