以減毒鼠傷寒沙門桿菌為載體的戊型肝炎疫苗免疫途徑和劑量的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(HEV)引起的戊型肝炎是一種嚴(yán)重危害公眾健康的全球性傳染病，主要經(jīng)胃腸道傳播。我國新疆南部曾因水源污染發(fā)生過世界上規(guī)模最大的戊型肝炎暴發(fā)流行，有約12萬人發(fā)病。近年來我國戊型肝炎的小規(guī)模流行和散發(fā)病例也有明顯增加。衛(wèi)生部公布的疫情報(bào)告把戊型肝炎列為發(fā)病明顯上升的病種。世界衛(wèi)生組織已將戊型肝炎疫苗列為21世紀(jì)最優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。 由于HEV細(xì)胞培養(yǎng)十分困難，故難以研制傳統(tǒng)的滅活疫苗或減毒活疫苗。國內(nèi)外研究者多致力于

2、基因工程重組蛋白疫苗的研發(fā)。但是，與HEV自然感染方式不同，現(xiàn)有的HEV重組蛋白疫苗大多經(jīng)注射途徑免疫，通常不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生胃腸道局部粘膜免疫反應(yīng)，而粘膜免疫在阻斷類似戊型肝炎等的胃腸道傳染病的發(fā)病中具有重要作用。因此研制一種接種方便、價(jià)格低廉、易于推廣、能同時(shí)誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫的戊型肝炎粘膜疫苗意義重大。 將腺苷酸環(huán)化酶基因(cya)和環(huán)化Amp受體蛋白基因(crp)缺失突變的減毒鼠傷寒沙門桿菌作為疫苗載體用于疫苗研發(fā)，其可行

3、性已被大量研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室在國內(nèi)外首次成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)含HEV中和抗原表位的ORF2編碼蛋白片段的戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門桿菌疫苗株X4550(pYA3341-179)，初步研究結(jié)果顯示該疫苗菌能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和粘膜免疫。本研究旨在通過不同免疫劑量，不同免疫途徑，研究戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門桿菌疫苗X4550(pYA3341-179)在小鼠體內(nèi)的免疫效果，確定優(yōu)選的免疫策略，達(dá)到適當(dāng)?shù)拿庖咴院偷透弊饔弥g的最佳平衡，

4、為戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門桿菌疫苗的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。 本研究分為兩部分： 一、戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門桿菌疫苗X550(pYA3341-179)的安全性研究 分別以口服和鼻飼兩種方式免疫小鼠，劑量為10<'3>CFu、10<'7>CFU、10<'10>CFU，于第4、8周加強(qiáng)免疫2次，通過監(jiān)測小鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)，找出疫苗接種劑量的安全范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在觀察期內(nèi)無小鼠死亡。與鼻飼PBS對照組相比，鼻飼10<'3>CF

5、U、10<'7>CFU兩組生存狀態(tài)良好，而鼻飼10<'10>CFU組小鼠首次免疫后就出現(xiàn)明顯的體重下降，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并出現(xiàn)豎毛、厭食、不活躍等現(xiàn)象，提示鼻飼免疫時(shí)劑量過高會(huì)影響小鼠的生理狀態(tài)。而口服各組小鼠對所給劑量的耐受性較好，只有口服10<'10>CFu組小鼠免疫后出現(xiàn)了一過性體重下降。 二、戊型肝炎減毒鼠傷寒沙門桿菌疫苗X550(pYA3341-179)不同免疫途徑和劑量的免疫效果研究 分別以口服和鼻飼兩種

6、方式免疫小鼠，劑量為10<'3>CFu、10<'7>CFU、10<'10>CFU，于第4、8周加強(qiáng)免疫2次，通過檢測各組小鼠產(chǎn)生的血清抗HEV-IgG及其亞類，糞便抗HEV-sIgA以及細(xì)胞免疫水平，評價(jià)疫苗的免疫效果，確定合適的免疫劑量和免疫途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各疫苗接種組小鼠均產(chǎn)生了全面的免疫應(yīng)答包括體液免疫、細(xì)胞免疫和粘膜免疫。無論是口服組還是鼻飼組，血清抗HEV-IgG和糞便抗HEV-sIgA的高低與劑量都有一定的相關(guān)性。其中口服10

7、<'10>CFU組小鼠糞便抗HEv-sIgA顯著高于10<'3>CFU劑量組(P<0.05)；鼻飼10<'10>CFU和10<'7>CFU組的血清抗HEV-IgG水平均顯著高于10<'3>CFU組(P<0.05)；鼻飼10<'10>CFU的糞便抗HEV-sIgA顯著高于10<'3>CFU組(P<0.05)。接種劑量為10<'7>CFU時(shí)，鼻飼組的抗HEV-IgG水平比口服組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生糞便抗HEV-sIgh方面

8、，等劑量接種的鼻飼組均優(yōu)于口服組，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清IgG2a/IgGl的檢測結(jié)果顯示，各組小鼠血清IgG都是以IgG2a亞類為主，免疫應(yīng)答具有Th1方向優(yōu)勢。另外本研究還進(jìn)行了口服和鼻飼10<'10>CFU兩組小鼠的脾淋巴細(xì)胞特異性增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠均產(chǎn)生了強(qiáng)烈的特異性脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。 總之，由于10<'10>CFU鼻飼接種時(shí)會(huì)影響小鼠的生理指標(biāo)，10<'7>CFU和10<'10>CFU劑量誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答