HSL的表達(dá)和活性與豚鼠精子發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、一、研究背景與目的 世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測，男性不育癥、癌癥和心血管病癥將成為21世紀(jì)危害人類健康最最嚴(yán)重的三大疾病。最近50年間，全球人類的精子質(zhì)量降低，生殖能力也大大下降。我國臨床統(tǒng)計，育齡夫婦中約10％-15％患有不育不孕癥；臺灣省每10對夫婦中約有一對不育；北京協(xié)和醫(yī)院專家對1980-1990年間診治的萬余例男性不育患者的統(tǒng)計結(jié)果，發(fā)現(xiàn)就診人數(shù)后5年竟是前5年的2-3倍。在南海市某地，1991-1995年的就診人數(shù)正

2、好比1981-1985年翻了一番。上述情況表明，男性不育癥患者正在全球范圍內(nèi)不斷增多。而在男性不育癥的原因當(dāng)中，精子發(fā)生障礙是其中一個重要的影響因素。 精子發(fā)生是一種依賴于分泌調(diào)節(jié)的發(fā)育過程，其特征是由未分化的雙倍體干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成高度分化的單倍體精子。這一分化過程是在雄性生殖腺(睪丸)的曲細(xì)精管上皮細(xì)胞中進(jìn)行的，并且依賴于支持細(xì)胞(Sertoli)與生精細(xì)胞的緊密接觸，在促黃體激素(corpus luteum-stimulatin

3、g hormone，LH)和促卵泡激素(folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH)的作用下Leydig細(xì)胞分泌睪丸激素-睪酮(testosterone，T)作用于Sertoli細(xì)胞，從而刺激基因轉(zhuǎn)錄和生殖細(xì)胞分化。 因此，T、FSH和LH在生精過程中是必需的，尤其T是精子發(fā)生過程中的至關(guān)重要的因素。FSH是啟動精子發(fā)生的重要因子。FSH通過環(huán)磷腺苷(cyclicadenosine monomphsopate

4、，cAMP)和鈣離子信號途徑直接調(diào)節(jié)支持細(xì)胞或生精細(xì)胞。FSH的作用可能是改變支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能，產(chǎn)生有利于精子發(fā)生的條件，從而啟動精子發(fā)生。LH作用于Leydig細(xì)胞，每一個Leydig細(xì)胞有6000個LH受體，LH與其受體的結(jié)合，Leydig細(xì)胞內(nèi)的c-AMP水平明顯提高，這表明LH能刺激腺苷環(huán)化酶的活性，膜電位(membrane potential，MP)水平升高激活蛋白激酶，促進(jìn)Leydig內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化，激活膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)樵邢?/p>

5、醇酮進(jìn)而增強T的合成。T是精子發(fā)生調(diào)節(jié)中最為重要因素，睪丸中類肌樣細(xì)胞和支持細(xì)胞是它的靶細(xì)胞。T作用于類肌細(xì)胞使之產(chǎn)生支持細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，最終以T和支持細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，實現(xiàn)對支持細(xì)胞的雙重調(diào)節(jié)。從分子水平看，精子發(fā)生和成熟分化過程是一系列特定基因程序性表達(dá)的過程，其中表達(dá)許多睪丸特異性基因，包括cAMP應(yīng)答元件調(diào)控因子、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、熱休克蛋白(heat shock protein，HSP70)、腫

6、瘤相關(guān)移植抗原(tumour-associated transplantation antigen，TATA)結(jié)合蛋白，EDDY將之統(tǒng)稱為“沙文基因”。在精子的生成過程中，一系列的基因表達(dá)和調(diào)控最終使得生精細(xì)胞表現(xiàn)出體細(xì)胞所沒有的形態(tài)特征和細(xì)胞行為以及特殊的功能。并且生精細(xì)胞的生長發(fā)育要求非常嚴(yán)格的特殊環(huán)境。目前國際上主要通過RNA干擾、免疫相關(guān)技術(shù)、構(gòu)建特殊的細(xì)胞系、以及轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠的方法研究與精子發(fā)生相關(guān)基因，對其分子基礎(chǔ)有

7、了長足的認(rèn)識。 本文的研究是基于激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)能調(diào)節(jié)脂肪酸、膽固醇以及類固醇的代謝，膽固醇代謝生成孕烯醇酮從而生成睪酮這一機制。并且睪酮是促使精子發(fā)生中最重要的因素的之一，且HSL在睪丸中的特異性表達(dá)，從而建立動物分組，從分子水平研究HSL在睪酮生成中的作用，以及HSL的表達(dá)及酶活性和精子發(fā)生及成熟的相關(guān)關(guān)系。 二、材料與方法 (一)材料 戊巴比妥

8、鈉、0.9％氯化鈉注射液、Frizol試劑、達(dá)暉RT-PCR反應(yīng)體系、西班牙瓊脂糖、達(dá)安基因?qū)嶒灠閭H、異丙醇、湘儀離心機、Eppendof冷凍離心機、北京六一電泳儀、捷達(dá)801凝膠成像分析系統(tǒng)、ABI9700擴增儀、EDTA溶液、buffer液以及激素測定試劑盒和脂肪酸測定試劑盒等。 (二)方法 1、將不同年齡階段的豚鼠依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果分成三組，分別為：6d的幼鼠、16d青春期豚鼠以及70d的成年豚鼠，每組6只；麻醉處死后收集

9、豚鼠的睪丸及附睪組織以及腹腔靜脈血液。 2、對左側(cè)睪丸、附睪組織進(jìn)行勻漿(分成三部分)，取一部分勻漿用半定量RT-PCR方法檢測睪丸和附睪組織中HSL的mRNA表達(dá)量，第二部分在37℃下比色法對HSL酶活性進(jìn)行測定，第三部分用甘油三酯和膽固醇酯試劑盒對睪丸勻漿中的膽固醇酯和甘油三酯進(jìn)行測定。 3、對抽取的血液進(jìn)行離心，放免法測定腹腔靜脈血清中睪酮、促黃體生成素、促卵泡激素水平。 4、對右側(cè)睪丸、附睪組織切片進(jìn)行H

10、E染色，并對睪丸和附睪組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析，觀察有無精子發(fā)生以及組織形態(tài)學(xué)的變化。 5、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。各年齡組間的HSLmRNA表達(dá)量、血清性激素水平、HSL酶活性、膽固醇酯和甘油三酯進(jìn)行方差分析(ONE-wayANOVA)檢驗，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時用Tambane's T2檢驗。HSL酶活性和膽固醇酯、甘油三酯以及血清中T、FSH、LH水平之間用Pearson

11、相關(guān)分析。 三、結(jié)果 1、發(fā)育階段的豚鼠隨著年齡的增加，睪丸特異性HSLmRNA表達(dá)70d組與6d和16d組間均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，而6d和16d組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，其表達(dá)逐漸增強； 2、HSL酶活性逐漸增強，各組間有均顯著性差異(F=145.418，P<0.05)；組間兩兩比較也均有統(tǒng)計學(xué)差異，也呈逐步遞增趨勢。HSL mRNA與HSL酶活性有明顯的正相關(guān)性。 3、各組間睪丸勻漿中膽固

12、醇酯有明顯差異(F=13.666，P=0.000)，組間兩兩比較，6d和16d以及70d比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，16d組和70d組的比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.162)。膽固醇酯的濃度從幼齡到成熟期呈逐步下降趨勢。而各年齡組間的甘油三酯含量通過方差分析顯示沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(F=2.887，P=0.087)。HSL酶活性與膽固醇酯有明顯的負(fù)相關(guān)性，但不與甘油三酯濃度相關(guān)。 4、血清中T、LH、FSH的水平逐漸升高，各組

13、的T水平有明顯差異(F=197.282，P<0.01)，6d和16d及70d組間的LH水平有明顯差異(P<0.05)，70d和16d組間沒有差異：各組間的FSH水平均有明顯差異(F=5.772，P=0.014)。 HSL的酶活性與T、FSH以及LH之間都有明顯相關(guān)性，并有統(tǒng)計學(xué)意義。5、組織形態(tài)學(xué)顯示6d的豚鼠睪丸及附睪組織中以精原細(xì)胞為主，未見精子細(xì)胞，16d組織中可見各級精原細(xì)胞，能見到部分精子細(xì)胞。70d的組織中可見大量的

14、成熟精子細(xì)胞。 四、結(jié)論 1、幼齡豚鼠睪丸及附睪中HSL mRNA表達(dá)和活性都非常低，整個發(fā)育階段，HSL mRNA及酶活性增長呈平行趨勢，HSL的表達(dá)決定了HSL的酶活性。 2、睪丸特異性HSL是豚鼠睪丸中膽固醇酯水解的底物酶，維持了膽固醇酯在睪丸中的濃度，并可能是唯一的底物酶，HSL的酶活性在膽固醇酯降解為睪酮過程中起著非常重要的作用。 3、HSL的表達(dá)與活性的增長在睪丸附睪組織的發(fā)育成熟中起著非常重