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文檔簡介
1、目的:擬通過檢測β-淀粉樣蛋白(Aβ)在臨床顱腦創(chuàng)傷(TBI)患者體液中表達(dá)量的改變,證實其參與TRI的進(jìn)展;構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SH-SY5Y-APP細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Aβ的細(xì)胞模型,采用亞低溫干預(yù)手段,證實該措施對細(xì)胞創(chuàng)傷起一定程度的保護(hù)作用;在此基礎(chǔ)上回歸體內(nèi)試驗,常規(guī)建立液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型,除給予亞低溫保護(hù)性干預(yù)外,應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素(EPO)及其與亞低溫聯(lián)合干預(yù),觀察治療效果,尋找顱腦創(chuàng)傷的新的
2、治療靶點,為臨床早期干預(yù)尋找新的方向。
方法:本課題分為三部份,第一部分:通過對60例小樣本的臨床病例進(jìn)行檢測,分別于患者入院后第0h、24h、48h、72h留取CSF、外周血,ELISA方法檢測Aβ含量,并采用GCS評分標(biāo)準(zhǔn)判斷預(yù)后評估,檢測Aβ在腦脊液及血清中的變化與預(yù)后的相關(guān)性。第二部分:構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達(dá)載體,常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞系,細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,western-blot方法檢測
3、細(xì)胞蛋白中APP是否表達(dá)及表達(dá)量高低,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)APP的細(xì)胞模型;并在此基礎(chǔ)上給予常溫及亞低溫培養(yǎng),檢測不同溫度條件下細(xì)胞生長情況。第三部分:制備液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型,大鼠造模結(jié)束后采用冰袋包裹頭部以下部位,30分鐘內(nèi)將體溫降至31℃保持溫度波動于31-33℃,5小時;其后將體溫升至37.5-38.5℃。rhEPO組大鼠致傷后即刻及每天腹腔內(nèi)注射(5000IU/kg)rhEPO,術(shù)后每12h肌注青霉素鈉40萬U。分別于手術(shù)后0.5h、2
4、h、6h、12h、24h、48h、72h,ELISA方法檢測血清及腦脊液中Aβ含量,病理檢查觀察TBI模型腦組織創(chuàng)傷情況,western-blot檢測不同干預(yù)方式腦組織中Aβ表達(dá)。
結(jié)果:第一部分實驗通過對小樣本的臨床病例的體液標(biāo)本進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷患者術(shù)后Aβ隨時間改變逐步升高,其機制涉及顱顱腦創(chuàng)傷可致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)傷,血腦屏障破壞,進(jìn)而使得崩解的細(xì)胞骨架中的AB進(jìn)入腦脊液及血液循環(huán),其表達(dá)水平與創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)。第
5、二部分的研究結(jié)合臨床檢驗的結(jié)果,選用真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP來轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系,基于細(xì)胞標(biāo)記示蹤理論依據(jù),并借助該實驗手段對細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)篩選,從而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并大量表達(dá)APP的細(xì)胞系。通過Western-blot進(jìn)一步證明了APP基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。并給予細(xì)胞株常溫培養(yǎng)及亞低溫培養(yǎng)兩種不同的干預(yù)措施,證實亞低溫對細(xì)胞創(chuàng)傷起一定程度的保護(hù)作用。第三部分進(jìn)行了體內(nèi)模型的構(gòu)建和研究,成功構(gòu)建了大鼠液壓沖擊顱顱腦創(chuàng)傷
6、模型,通過神經(jīng)系統(tǒng)評分鑒定了模型的可行性,在此基礎(chǔ)上分別給予亞低溫、EPO、及兩者聯(lián)合干預(yù)治療的方式,證實亞低溫聯(lián)合EPO可有效保護(hù)顱腦創(chuàng)傷后大腦功能的改變,為進(jìn)一步深入展開創(chuàng)傷性顱腦的治療提供新的治療靶點及理論依據(jù)。
結(jié)論:在常規(guī)治療的同時,采用亞低溫治療可抑制重型顱顱腦創(chuàng)傷患者的Aβ的表達(dá)及ICP水平并提高患者預(yù)后,Aβ作為一種新生物標(biāo)記物,其動態(tài)變化與顱顱腦創(chuàng)傷創(chuàng)傷程度有一定相關(guān)性,Aβ含量變化作為患者預(yù)后一項評定指標(biāo)。
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