促紅細(xì)胞生成素抑制血管重構(gòu)的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　研究促紅細(xì)胞生成素（EPO）對血管新生內(nèi)膜及其膠原分泌的影響，探討轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）在其中的作用，并闡述TGF-β1/MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）信號傳導(dǎo)參與的作用機(jī)制。通過大鼠頸動脈球囊損傷動物模型，觀察EPO抑制血管內(nèi)皮損傷后血管重構(gòu)的影響，進(jìn)一步闡述再狹窄相關(guān)發(fā)病機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供新思路。
　　方法：
　　1、實驗動物分組及造模將清潔級健康SD大鼠75只（雌雄不限），按照隨機(jī)分配原

2、則將大鼠分為五組，對照組，損傷組（球囊損傷頸動脈組），EPO組（損傷組基礎(chǔ)上行EPO(3000U/kg)腹腔注射干預(yù)），TGF-β1組（EPO組基礎(chǔ)上頸動脈外膜普朗尼克凝膠固定TGF-β1(0.5mg/ml)干預(yù)），MMP-2組（EPO組基礎(chǔ)上頸動脈外膜普朗尼克凝膠固定MMP-2(0.5mg/ml)干預(yù)）。采用PTCA球囊損傷大鼠單側(cè)頸動脈的方法制造模型。每組大鼠按不同的時相點分別于術(shù)后第1、7、14天麻醉后處死。術(shù)前心尖內(nèi)取血，并將術(shù)

3、側(cè)大鼠頸動脈切取2cm，所有血管組織標(biāo)本取出后，用于相關(guān)指標(biāo)的檢測。
　　2、實驗指標(biāo)檢測大鼠血管組織行常規(guī)切片和HE染色，觀察組織病理學(xué)變化。行ELISA法檢測大鼠血清中VEGF和TNF-α水平，選用Masson染色方法對膠原纖維進(jìn)行染色。應(yīng)用免疫組化染色檢測血管組織中的TGF-β1、MMP-2的表達(dá)。采用Real-timePCR法檢測eNOSmRNA水平。采用Westernblot法檢測P-Akt和T-Akt蛋白的表達(dá)。

4、>　　3、病理結(jié)果分析采用數(shù)字圖像分析系統(tǒng)對血管標(biāo)本形態(tài)學(xué)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計數(shù)分析。應(yīng)用膠原纖維表達(dá)面積與其血管層面積的百分比作為膠原密度。經(jīng)免疫組化評分方法作為TGF-β1、MMP-2的表達(dá)結(jié)果，應(yīng)用目的基因的相對表達(dá)量作為eNOSmRNA的水平。用凝膠成像系統(tǒng)成像分析，以光密度相對灰度值作為P-Akt和T-Akt蛋白的表達(dá)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1、血管組織新生內(nèi)膜厚度及面積比結(jié)果：
　?、賹φ战M之間各時間點無顯著差異（

5、P>0.05）；②損傷組對比對照組，內(nèi)膜損傷程度增加，新生內(nèi)膜及面積比增加，并隨時間增加而加劇，各時間點差異有顯著性（P<0.05）；③EPO組對比損傷組新生內(nèi)膜厚度明顯減輕，面積比明顯減??；但7d與14dEPO組之間無明顯差異（P>0.05）；③TGF-β1組、MMP-2組對比EPO組新生內(nèi)膜厚度及面積比增加，與EPO組比較有明顯差異（P<0.05）；
　　2、血清VEGF和TNF-α表達(dá)結(jié)果：
　　①對照組各時間點無明顯

6、差異（P>0.05）；②1d損傷組VEGF及TNF-α表達(dá)即刻升高，至7d后仍維持在較高水平，至14d明顯增高；EPO組各時間點水平較對照組升高，但與損傷組比較明顯降低，有明顯差異（P<0.05）；③TGF-β1組、MMP-2組在損傷即刻與損傷組無明顯差別，至7d、14d后，兩組VEGF及TNF-α較EPO組表達(dá)升高，差異具有顯著性（P<0.05）：
　　3、血管組織膠原纖維表達(dá)結(jié)果
　?、賹φ战M各時間點無明顯差異（P>0.

7、05）；②1d損傷組膠原表達(dá)減低，7d再次升高，14d達(dá)到峰值；EPO組各時間點較損傷組值減低，差異有顯著性（P<0.05）；③14d損傷組、14dTGF-β1組較對照組染色面積值有升高，14dTGF-β1組中較14dEPO組升高明顯，且差異有顯著性（P<0.05）。
　　4、血管組織TGF-β1免疫組化染色評分：
　?、賹φ战M各時間點可見TGF-β1少量表達(dá)，無明顯差異（P>0.05）；損傷組、TGF-β1組該因子表達(dá)增強(qiáng)

8、，與對照組比較，差異有顯著性（P<0.05）；②損傷組中TGF-β1表達(dá)在7d,14d表達(dá)開始明顯增加，與1d比較有差異顯著性（P<0.05）。③EPO組各時間點較損傷組表達(dá)減輕，差異有顯著性（P<0.05）；④TGF-β1組TGF-β1表達(dá)明顯增加，染色加深，且隨著時間的延長，表達(dá)逐漸增加，與損傷組同一時間點比較，有差異顯著性（P<0.05）。
　　5、血管組織MMP-2免疫組化染色評分：
　?、賹φ战M各時間點表達(dá)少量，無

9、明顯差異（P>0.05）；②損傷組、TGF-β1組、MMP-2組與對照組比較，MMP-2值表達(dá)有差異顯著性（P<0.05）；③但同一時間點TGF-β1組與MMP-2組間MMP-2的表達(dá)無顯著差異（P>0.05）。④EPO組各時間點較損傷組表達(dá)減輕，差異有顯著性（P<0.05）；
　　6、血管組織eNOSmRNA的水平結(jié)果：
　?、贀p傷組eNOSmRNA水平較對照組降低，兩者比較有明顯差異（P<0.05）；②EPO組eNOSm

10、RNA水平較損傷組明顯增加，差異有顯著性（P<0.05）；③TGF-β1及MMP-2組較EPO組，eNOSmRNA水平減低，但以TGF-β1組減低明顯，且差異有顯著性（P<0.05）
　　7、血管組織P-Akt和T-Akt蛋白表達(dá)結(jié)果：
　?、贀p傷組中P-Akt和T-Akt表達(dá)與對照組之間比較差異不明顯（P>0.05）。②EPO組中以P-Akt表達(dá)增加最為明顯，與損傷組比較，差異具有顯著性（P<0.05）；③TGF-β1組中

11、P-Akt的表達(dá)減低明顯，與EPO組比較差異具有顯著性，但T-Akt表達(dá)無明顯變化（P<0.05）。④MMP-2組中P-Akt表達(dá)與EPO組降低，差異具有顯著性，但T-Akt表達(dá)較EPO組無明顯降低，差異具有顯著性。
　　結(jié)論：
　　1、損傷組TGF-β1、MMP-2、VEGF、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)是增強(qiáng)的。
　　2、EPO組的新生內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜與中膜面積比，及TGF-β1、MMP-2、VEGF、TNF-α等細(xì)胞