肺臟NK細(xì)胞與呼吸道病毒感染.pdf

1、自然殺傷細(xì)胞(Natural Killer cells，NK細(xì)胞)是構(gòu)成機(jī)體防御第一道防線的固有淋巴細(xì)胞之一。NK細(xì)胞能夠通過(guò)多種受體傳遞活化或者抑制信號(hào)?；罨允荏w包括自然殺傷受體(NCRs)，如NKp46和NKp44、Fc受體CD16以及NKG2D。抑制性受體包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KiRs)以及NKG2A：CD94二聚體。同時(shí)，NK細(xì)胞也可以被細(xì)胞因子活化，如I型干擾素、IL-12和IL-18。NK細(xì)胞一旦被活化就能夠通過(guò)釋

2、放殺傷顆粒到突觸部位直接殺傷靶細(xì)胞。由于NK細(xì)胞的功能已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出自然殺傷細(xì)胞的功能，我們對(duì)NK細(xì)胞的認(rèn)識(shí)也在快速地更新。最重要的是，NK細(xì)胞是重要的早期細(xì)胞因子的來(lái)源，特別是分泌IFN-γ，也可以分泌Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，比如IL-5，IL-13以及調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10。此外，NK細(xì)胞還能夠與樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互活化以及能夠影響獲得性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。NK細(xì)胞與病毒感染之間的關(guān)系一直是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)

3、胞在病毒感染中扮演了抵抗病毒感染保護(hù)機(jī)體或者導(dǎo)致?lián)p傷促進(jìn)疾病發(fā)生的雙重角色。
　　 肺臟是一個(gè)很特殊的器官，時(shí)時(shí)刻刻接受來(lái)自外界環(huán)境中的非己物質(zhì)以及各種微生物的刺激。肺臟特殊的環(huán)境決定了其免疫系統(tǒng)的特殊性，比如肺臟免疫應(yīng)答的閾值較高。NK細(xì)胞在特殊的組織中也會(huì)有特殊的功能，比如最近發(fā)現(xiàn)的在腸道和扁桃體存在分泌IL-22的NK細(xì)胞，這種細(xì)胞之后被證明在肺臟細(xì)菌和病毒感染中也均會(huì)出現(xiàn)。呼吸道是外界病原體進(jìn)入機(jī)體的重要通道，NK細(xì)胞快

4、速應(yīng)答感染的能力就意味著它在急性的肺臟感染中有舉足輕重的作用。那么，肺臟NK細(xì)胞在表型和功能上與其他組織器官的NK細(xì)胞有何不同呢?這正是我們所關(guān)心的問(wèn)題。
　　 本論文的目的在于研究肺臟NK細(xì)胞在呼吸道病毒感染中的重要作用，重點(diǎn)探討了小鼠肺臟NK細(xì)胞在呼吸道合胞病毒(RSV)感染中的作用，并比較了小鼠肺臟與其他臟器NK細(xì)胞的表型差異，以期為更好地全面地理解肺臟NK細(xì)胞的功能提供線索。
　　 在本論文中，我們分離了BALB

5、/c和C57BL/6小鼠淋巴結(jié)、骨髓、脾臟、外周血、肝臟和肺臟的單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了NK細(xì)胞的表型；利用6～10周的成年SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，通過(guò)鼻腔接種106PFU的人RSV病毒懸液建立RSV感染模型；利用H&E染色的方法檢測(cè)小鼠肺臟的病理改變；通過(guò)ELISA方法檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞因子的水平；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺臟淋巴細(xì)胞亞群比例的變化，以及淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況；利用胞內(nèi)細(xì)胞染色的方法

6、檢測(cè)NK細(xì)胞細(xì)胞因子以及功能分子的產(chǎn)生；采用尾靜脈注射兔抗小鼠AsGM-1抗體來(lái)清除小鼠NK細(xì)胞。通過(guò)以上一系列的研究方法，我們得到了如下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.小鼠肺臟存在高比例的NK細(xì)胞首先我們比較了正常小鼠不同臟器NK細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠中，NK細(xì)胞在不同臟器中的分布是有區(qū)別的。在淋巴結(jié)中NK細(xì)胞的比例僅占淋巴細(xì)胞的0.5％左右；在骨髓和脾臟中NK細(xì)胞比例在2％左右；在外周血中NK細(xì)胞比例

7、略高，占到了3～4％；在肝臟中NK細(xì)胞比例較高，占到了6～8％，在肺臟中NK細(xì)胞比例最高，占了10～12％。因此，按照NK細(xì)胞比例從高到低排序應(yīng)該是肺臟>肝臟>外周血>脾臟>骨髓>淋巴結(jié)。
　　 2.小鼠肺臟NK細(xì)胞有較成熟的表型通過(guò)對(duì)C57BL/6小鼠各臟器NK細(xì)胞表面CD27和CD11b分子的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)肺臟NK細(xì)胞中CD27lowCD11bhigh的群體與其他臟器NK細(xì)胞相比比例最高(大于70％)，而肺臟NK細(xì)胞中CD2

8、7lowCD11blow，CD27highCD11blow和CD27highCD11bhigh的這三個(gè)群體卻比其他臟器比例都低。此外，肺臟NK細(xì)胞中表達(dá)DX5、CD11b、CD122、Ly49s、CD43的比例較其他臟器NK細(xì)胞都高，尤其DX5、CD11b、CD122和CD43表達(dá)的比例都在90％以上，而肺臟NK細(xì)胞表達(dá)CD51分子的比例(僅0.6％)卻較其他臟器NK細(xì)胞都低。因此，基于這樣的表型，說(shuō)明肺臟NK細(xì)胞在發(fā)育上可能處于較成熟

9、的階段。
　　 3.小鼠肺臟NK細(xì)胞處于靜息狀態(tài)比較分析了肺臟與骨髓和脾臟NK細(xì)胞的表型差異，發(fā)現(xiàn)肺臟NK細(xì)胞表面表達(dá)較高的抑制性受體，如CD94和NKG2A，而表達(dá)較低的活化性受體，如NKp46、NKG2D和CD69；而且肺臟NK細(xì)胞表面與遷移相關(guān)的分子表達(dá)均較低，如粘附分子CD11a、CD18、CD244、CD48、CD62L、CD44和CD11c，趨化因子受體CCR5和CXCR2；此外，肺臟NK細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)也是較

10、低的，如CD86、B220、CD1d、PDL1和PD1等。這些結(jié)果都表明在正常狀況下肺臟NK細(xì)胞處于一個(gè)非活化的靜息狀態(tài)。
　　 4.呼吸道微生物感染誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化并獲得功能通過(guò)給小鼠呼吸道感染流感病毒、金黃色葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)這些感染都能夠在3天之內(nèi)對(duì)肺臟NK細(xì)胞有不同程度的活化，使其表面活化性標(biāo)志CD69分子的表達(dá)上調(diào)。在這些微生物感染過(guò)程中雖然脾臟NK細(xì)胞也會(huì)有所活化，但其活化程度遠(yuǎn)不及肺臟NK細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)

11、肺炎克雷伯菌感染2天后小鼠肺臟NK細(xì)胞表達(dá)功能分子的情況。發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的感染能夠顯著上調(diào)肺臟NK細(xì)胞表面CD107a、TRAIL，以及FasL，的表達(dá)，以及分泌IFN-γ和顆粒酶B的能力。以上結(jié)果表明，盡管肺臟NK細(xì)胞在正常情況下是處于靜息狀態(tài)，但是當(dāng)有呼吸道感染時(shí)，肺臟NK細(xì)胞會(huì)迅速活化并且表達(dá)殺傷相關(guān)的分子和分泌細(xì)胞因子參與到宿主抵抗呼吸道感染的免疫應(yīng)答中。
　　 5.NK細(xì)胞參與RSV感染引起的小鼠肺免疫損傷通過(guò)RSV

12、小鼠感染模型，發(fā)現(xiàn)RSV能夠誘導(dǎo)嚴(yán)重的急性肺免疫損傷；在病毒感染的早期NK細(xì)胞大量聚集在肺臟并且被活化；活化的NK細(xì)胞高表達(dá)活化性受體NKG2D和CD27成為有功能的細(xì)胞，并且具有分泌大量IFN-γ的的能力。NK細(xì)胞的清除能夠顯著減輕肺免疫損傷，并且減少BALF中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及降低BALF中IFN-γ的水平。這些結(jié)果均表明在RSV感染早期NK參與了急性肺免疫損傷，并且這個(gè)過(guò)程是通過(guò)分泌IFN-γ來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 綜上所述，本

13、論文的研究得到以下結(jié)論：在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠肺臟分布著高比例的NK細(xì)胞，這些NK細(xì)胞具有較成熟的表型。當(dāng)呼吸系統(tǒng)在正常狀態(tài)時(shí)，肺臟NK細(xì)胞是處于靜息狀態(tài)的。當(dāng)呼吸道有感染發(fā)生時(shí)，肺臟NK細(xì)胞會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)活化并且發(fā)揮其功能；發(fā)現(xiàn)在呼吸道合胞病毒感染過(guò)程中NK細(xì)胞在早期參與了的急性肺免疫損傷的發(fā)生，并且這一過(guò)程是通過(guò)NK細(xì)胞分泌IFN-γ來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究全面描繪了小鼠肺臟NK細(xì)胞的表型，并且闡述了NK細(xì)胞在肺臟穩(wěn)態(tài)和肺臟