肺臟NK細胞與呼吸道病毒感染.pdf

1、自然殺傷細胞(Natural Killer cells，NK細胞)是構(gòu)成機體防御第一道防線的固有淋巴細胞之一。NK細胞能夠通過多種受體傳遞活化或者抑制信號。活化性受體包括自然殺傷受體(NCRs)，如NKp46和NKp44、Fc受體CD16以及NKG2D。抑制性受體包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KiRs)以及NKG2A：CD94二聚體。同時，NK細胞也可以被細胞因子活化，如I型干擾素、IL-12和IL-18。NK細胞一旦被活化就能夠通過釋

2、放殺傷顆粒到突觸部位直接殺傷靶細胞。由于NK細胞的功能已經(jīng)遠遠超出自然殺傷細胞的功能，我們對NK細胞的認識也在快速地更新。最重要的是，NK細胞是重要的早期細胞因子的來源，特別是分泌IFN-γ，也可以分泌Th2相關的細胞因子，比如IL-5，IL-13以及調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10。此外，NK細胞還能夠與樹突狀細胞和巨噬細胞相互活化以及能夠影響獲得性免疫應答的產(chǎn)生。NK細胞與病毒感染之間的關系一直是免疫學研究的熱點之一，近年來的研究發(fā)現(xiàn)NK細

3、胞在病毒感染中扮演了抵抗病毒感染保護機體或者導致?lián)p傷促進疾病發(fā)生的雙重角色。
　　 肺臟是一個很特殊的器官，時時刻刻接受來自外界環(huán)境中的非己物質(zhì)以及各種微生物的刺激。肺臟特殊的環(huán)境決定了其免疫系統(tǒng)的特殊性，比如肺臟免疫應答的閾值較高。NK細胞在特殊的組織中也會有特殊的功能，比如最近發(fā)現(xiàn)的在腸道和扁桃體存在分泌IL-22的NK細胞，這種細胞之后被證明在肺臟細菌和病毒感染中也均會出現(xiàn)。呼吸道是外界病原體進入機體的重要通道，NK細胞快

4、速應答感染的能力就意味著它在急性的肺臟感染中有舉足輕重的作用。那么，肺臟NK細胞在表型和功能上與其他組織器官的NK細胞有何不同呢?這正是我們所關心的問題。
　　 本論文的目的在于研究肺臟NK細胞在呼吸道病毒感染中的重要作用，重點探討了小鼠肺臟NK細胞在呼吸道合胞病毒(RSV)感染中的作用，并比較了小鼠肺臟與其他臟器NK細胞的表型差異，以期為更好地全面地理解肺臟NK細胞的功能提供線索。
　　 在本論文中，我們分離了BALB

5、/c和C57BL/6小鼠淋巴結(jié)、骨髓、脾臟、外周血、肝臟和肺臟的單個核細胞，通過流式細胞術檢測了NK細胞的表型；利用6～10周的成年SPF級BALB/c雌性小鼠，通過鼻腔接種106PFU的人RSV病毒懸液建立RSV感染模型；利用H&E染色的方法檢測小鼠肺臟的病理改變；通過ELISA方法檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子的水平；利用流式細胞術檢測肺臟淋巴細胞亞群比例的變化，以及淋巴細胞表面分子的表達情況；利用胞內(nèi)細胞染色的方法

6、檢測NK細胞細胞因子以及功能分子的產(chǎn)生；采用尾靜脈注射兔抗小鼠AsGM-1抗體來清除小鼠NK細胞。通過以上一系列的研究方法，我們得到了如下的實驗結(jié)果：
　　 1.小鼠肺臟存在高比例的NK細胞首先我們比較了正常小鼠不同臟器NK細胞的比例，發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠中，NK細胞在不同臟器中的分布是有區(qū)別的。在淋巴結(jié)中NK細胞的比例僅占淋巴細胞的0.5％左右；在骨髓和脾臟中NK細胞比例在2％左右；在外周血中NK細胞比例

7、略高，占到了3～4％；在肝臟中NK細胞比例較高，占到了6～8％，在肺臟中NK細胞比例最高，占了10～12％。因此，按照NK細胞比例從高到低排序應該是肺臟>肝臟>外周血>脾臟>骨髓>淋巴結(jié)。
　　 2.小鼠肺臟NK細胞有較成熟的表型通過對C57BL/6小鼠各臟器NK細胞表面CD27和CD11b分子的檢測，我們發(fā)現(xiàn)肺臟NK細胞中CD27lowCD11bhigh的群體與其他臟器NK細胞相比比例最高(大于70％)，而肺臟NK細胞中CD2

8、7lowCD11blow，CD27highCD11blow和CD27highCD11bhigh的這三個群體卻比其他臟器比例都低。此外，肺臟NK細胞中表達DX5、CD11b、CD122、Ly49s、CD43的比例較其他臟器NK細胞都高，尤其DX5、CD11b、CD122和CD43表達的比例都在90％以上，而肺臟NK細胞表達CD51分子的比例(僅0.6％)卻較其他臟器NK細胞都低。因此，基于這樣的表型，說明肺臟NK細胞在發(fā)育上可能處于較成熟

9、的階段。
　　 3.小鼠肺臟NK細胞處于靜息狀態(tài)比較分析了肺臟與骨髓和脾臟NK細胞的表型差異，發(fā)現(xiàn)肺臟NK細胞表面表達較高的抑制性受體，如CD94和NKG2A，而表達較低的活化性受體，如NKp46、NKG2D和CD69；而且肺臟NK細胞表面與遷移相關的分子表達均較低，如粘附分子CD11a、CD18、CD244、CD48、CD62L、CD44和CD11c，趨化因子受體CCR5和CXCR2；此外，肺臟NK細胞上共刺激分子的表達也是較

10、低的，如CD86、B220、CD1d、PDL1和PD1等。這些結(jié)果都表明在正常狀況下肺臟NK細胞處于一個非活化的靜息狀態(tài)。
　　 4.呼吸道微生物感染誘導NK細胞活化并獲得功能通過給小鼠呼吸道感染流感病毒、金黃色葡萄球菌或者肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)這些感染都能夠在3天之內(nèi)對肺臟NK細胞有不同程度的活化，使其表面活化性標志CD69分子的表達上調(diào)。在這些微生物感染過程中雖然脾臟NK細胞也會有所活化，但其活化程度遠不及肺臟NK細胞。通過檢測

11、肺炎克雷伯菌感染2天后小鼠肺臟NK細胞表達功能分子的情況。發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌的感染能夠顯著上調(diào)肺臟NK細胞表面CD107a、TRAIL，以及FasL，的表達，以及分泌IFN-γ和顆粒酶B的能力。以上結(jié)果表明，盡管肺臟NK細胞在正常情況下是處于靜息狀態(tài)，但是當有呼吸道感染時，肺臟NK細胞會迅速活化并且表達殺傷相關的分子和分泌細胞因子參與到宿主抵抗呼吸道感染的免疫應答中。
　　 5.NK細胞參與RSV感染引起的小鼠肺免疫損傷通過RSV

12、小鼠感染模型，發(fā)現(xiàn)RSV能夠誘導嚴重的急性肺免疫損傷；在病毒感染的早期NK細胞大量聚集在肺臟并且被活化；活化的NK細胞高表達活化性受體NKG2D和CD27成為有功能的細胞，并且具有分泌大量IFN-γ的的能力。NK細胞的清除能夠顯著減輕肺免疫損傷，并且減少BALF中炎癥細胞的浸潤以及降低BALF中IFN-γ的水平。這些結(jié)果均表明在RSV感染早期NK參與了急性肺免疫損傷，并且這個過程是通過分泌IFN-γ來實現(xiàn)的。
　　 綜上所述，本

13、論文的研究得到以下結(jié)論：在C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠肺臟分布著高比例的NK細胞，這些NK細胞具有較成熟的表型。當呼吸系統(tǒng)在正常狀態(tài)時，肺臟NK細胞是處于靜息狀態(tài)的。當呼吸道有感染發(fā)生時，肺臟NK細胞會在較短時間內(nèi)活化并且發(fā)揮其功能；發(fā)現(xiàn)在呼吸道合胞病毒感染過程中NK細胞在早期參與了的急性肺免疫損傷的發(fā)生，并且這一過程是通過NK細胞分泌IFN-γ來實現(xiàn)的。本研究全面描繪了小鼠肺臟NK細胞的表型，并且闡述了NK細胞在肺臟穩(wěn)態(tài)和肺臟